01
研究背景
纳米材料在生物医学领域具有巨大的应用潜力。然而，这些材料在体内给药时，通常会自发与生物环境中的蛋白质作用，在纳米材料周围形成蛋白冠。蛋白冠的组成和性质对纳米颗粒的生物分布、代谢途径以及免疫反应有显著影响，直接决定了纳米药物的疗效。因此，调控蛋白冠的组成，以最大化纳米药物的治疗效果具有重要意义。
为此，该研究提出了一种主动调控策略，通过在纳米颗粒表面预修饰纳米抗体 (Nbs) 来精确调控蛋白冠的形成。这种定点修饰使 Nbs 的活性位点暴露在外部，使纳米抗体的靶向识别功能、纳米颗粒与底物的接触不受影响。蛋白质组学分析显示，预修饰的 Nbs 能够调节纳米颗粒与血浆蛋白的亲和性，从而显著影响纳米颗粒的体内分布、代谢行为及免疫反应。这一研究实现了纳米材料表面蛋白冠的主动调控，有望为提高纳米药物的应用提供一种有效的策略。
02
研究内容
近日，中国科学技术大学刘扬中教授、程珺洁副研究员合作报道纳米材料的蛋白冠主动调控策略。该研究以金纳米颗粒 (AuNPs) 为例，预先修饰了不同种类的 Nbs，包括靶向 EGFR 的纳米抗体 (NbEGFR) 和靶向血清白蛋白的纳米抗体 (NbAlb)，研究不同种类的蛋白冠主动调控对纳米材料体内行为的关键影响。
图1 以纳米抗体修饰纳米金，分析蛋白冠的主动调控作用。
研究首先通过 DLS、TEM、SDS-PAGE 和 UV-vis 等表征方法分析 Au-PEG-Nb 的物理化学特性，验证了纳米金表面 Nbs 的成功修饰 (图2)。结果显示，Au-PEG-Nb 在生理环境中表现出良好的稳定性，适用于后续的生物学研究。
图2 Au-PEG-Nb 的制备与表征。(a) Au-PEG-Nb 制备过程的示意图。(b) 对 Au-Cit、Au-PEG、Au-PEG-NbEGFR 和 Au-PEG-NbAlb 的动态光散射 (DLS) 分析。(c) 对 Au-Cit、Au-PEG、Au-PEG-NbEGFR 和 Au-PEG-NbAlb 的 Zeta 电位分析。(d) 金纳米颗粒的透射电子显微镜 (TEM) 图像。(e) SDS-PAGE 分析 Au-PEG-Nb 偶联反应中上清液 (第1泳道为 NbEGFR，第3泳道为 NbAlb)和从 Au-PEG-Nb 偶联物中释放的 PEG-Nb (第2泳道为 PEG-NbEGFR ，第4泳道为 PEG-NbAlb)。(f) PBS 缓冲液中金纳米颗粒的紫外/可见光光谱 (UV/vis)。(g) PBS 缓冲液中金纳米颗粒在48小时内的稳定性。
对于 Au-PEG-Nb 表面蛋白冠的形成，研究进一步通过 TEM、DLS、SDS-PAGE 和 UV-vis 等方法分析了蛋白冠在纳米颗粒表面的结合 (图3)。结果表明，PEG 和 Nbs 的预修饰显著减少了纳米颗粒表面蛋白质的吸附量，使得不同修饰的纳米颗粒表现出不同的水合粒径。此外，Nbs 也对蛋白冠的组成产生了显著影响。
图3 Au-PEG-Nb 表面蛋白冠的表征。(a) 金纳米颗粒表面蛋白冠的透射电子显微镜 (TEM) 图像。(b) 金纳米颗粒在形成蛋白冠前后的动态光散射 (DLS) 分析。(c) Au-Cit (1)、Au-PEG (2)、Au-PEG-NbEGFR (3) 和 Au-PEG-NbAlb (4)表面蛋白冠的 SDS-PAGE 分析。PEG-NbEGFR 和 PEG-NbAlb 分别用红色和蓝色框标出。(d) 金纳米颗粒形成蛋白冠后的紫外/可见光光谱 (UV/vis)。
通过定量液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 进一步分析研究了不同表面修饰的金纳米颗粒 (AuNPs) 形成的蛋白冠的种类 (图4)。结果显示，PEG 修饰的 AuNPs 减少了补体成分和糖蛋白的吸附，延长了血液循环时间；而抗 EGFR 纳米抗体修饰的 AuNPs 则增强了免疫细胞的识别和激活。此外，抗白蛋白纳米抗体修饰的 AuNPs 显著增加了蛋白冠中白蛋白的含量。这些结果表明，通过纳米抗体修饰可以主动调控蛋白冠的组成，从而影响纳米药物的生物学行为。
图4 AuNPs 表面形成的蛋白冠的蛋白质组学分析。(a) 各组表达的热图。(b) 四组中所有蛋白的韦恩图。(c) 金纳米颗粒表面蛋白冠成分的相对丰度及分类。(d) 各组中相对丰度最高的前十种蛋白。使用 MaxQuant 进行分析。
值得注意的是，Au-PEG-NbEGFR 在蛋白冠形成后仍能保持其内在特性和靶向能力，在 EGFR 高表达的 A431 肿瘤细胞中显示出显著的细胞摄取和靶向性。荧光显微镜、流式细胞术和 ICP-MS 的分析结果均表明蛋白冠的形成并未削弱纳米抗体的靶向能力。此外，荧光猝灭实验进一步证实，蛋白冠的形成不会影响纳米颗粒的功能性，体现了纳米抗体修饰在保持纳米材料功能方面的有效性 (图5)。
图5 蛋白冠对 Nbs 体外靶向功能的影响。(a) A431 和 MCF-7 细胞摄取 Au-PEG-NbEGFR 的共聚焦图像。(b) 图 (a) 中相对荧光强度的定量分析。(c, d) A431 细胞 (c) 和 MCF-7 细胞 (d) 对金纳米颗粒的摄取情况。
最后，该研究在小鼠模型中考察了主动调控蛋白冠对纳米颗粒生物分布和体内循环的影响。结果显示，不同 Nbs 的预修饰使纳米颗粒表面形成了不同种类的蛋白冠，特别是在抗白蛋白纳米抗体 (NbAlb) 修饰的纳米颗粒中观察到了明显的白蛋白条带，验证了蛋白冠主动调控的有效性。此外，在 EGFR 高表达的小鼠肿瘤模型中，NbEGFR 修饰的纳米颗粒在肿瘤部位的积累显著增加，表明 NbEGFR 介导的蛋白冠在纳米颗粒的肿瘤靶向中具有良好的有效性。提供对白蛋白亲和性较高的 NbAlb 修饰，显著延长了纳米颗粒在血液中的循环时间，可有效防止了纳米颗粒的过快清除。这些结果证实了通过 Nbs 调控蛋白冠的策略在调节纳米颗粒代谢和提高治疗效果方面的积极作用及其广泛的应用潜力。(图6)。
图6 蛋白冠对 AuNPs 在体内的影响。(a) 蛋白冠的 SDS-PAGE 分析过程。(b) 与小鼠血浆孵育后获得的金纳米颗粒表面蛋白冠的 SDS-PAGE 分析。(1) Au-Cit (2) Au-PEG (3) Au-PEG-NbEGFR (4) Au-PEG-NbAlb。PEG-NbEGFR、PEG-NbAlb 和白蛋白分别用黑色、蓝色和红色框标出。(c) 体内蛋白冠形成的分析过程。(d) 金纳米颗粒在肿瘤中的分布。(e) 金纳米颗粒的体内代谢行为。(f) 金纳米颗粒在12小时时间点的滞留情况。
03
总结展望
该研究提出了一种创新的蛋白冠主动调控策略，通过在纳米颗粒表面定点修饰纳米抗体 (Nbs)，以主动调控纳米颗粒表面蛋白冠的组成和数量，不同的纳米抗体可获得不同的蛋白冠组成，使相应的纳米颗粒表现出不同体内分布、代谢行为及免疫反应，显示这一策略潜在的应用前景。
蛋白冠的形成是纳米材料进入体内的必然结果。该研究提出的蛋白冠主动调控策略能够有效调节纳米材料表面的吸附蛋白，从而影响其体内行为。这一策略有望为未来的纳米药物设计，如提高药物靶向递送、改善体内循环与代谢、降低毒副作用和增强疗效等方面提供有效的帮助，以拓展纳米材料在生物医学领域的应用。
04
论文信息
Active regulation of protein coronas for enhancing the in vivo biodistribution and metabolism of nanoparticles
Duo Jin, Manman Liu, Yajie Zhang, Wenxin Yu, Jiaji Yu, Ying Luo, Junjie Cheng and Yangzhong Liu
Inorg. Chem. Front., 2024, 11, 5741-5752
https://doi.org/10.1039/D4QI01000K
*文中图片皆来源上述文章
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