《J. Agric. Food Chem.》Huangshui多糖酶解新型寡糖的制备、结构分析及肠道益生菌特性研究
文摘
科学
2024-06-26 19:50
江苏
2023年12月，来自北京工商大学的Jihong Wu等人在J. Agric. Food Chem.上发表了一篇题为Preparation, Structural Analysis, and Intestinal Probiotic Properties of a Novel Oligosaccharide from Enzymatic Degradation of Huangshui Polysaccharide的研究性论文。
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通讯单位：Key Laboratory of Brewing Molecular Engineering of China Light Industry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; Beijing Laboratory of Food Quality and Safety and College of Chemistry and Materials Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China
Abstract
Huangshui多糖(HSP)因其潜在的健康益处而受到越来越多的关注。虽然HSP是制备寡糖的优良来源，但目前尚无相关研究报道。本研究通过酶解粗HSP (cHSP)制备了分子量为1791 Da、聚合度为11的新型寡糖(HSO)。甲基化和核磁共振分析表明，HSO的主链是(1→4)-α-D-葡萄糖，有两个O-6连接的支链。形态学观察表明，HSO表面光滑，具有片层状和丝状结构，聚糖大小在0.03-0.20 μm之间。值得注意的是，HSO显著促进了双歧杆菌、拟杆菌和Phascolarctobacterium的增殖，从而使肠道微生物群组成发生了积极的变化。此外，HSO在体外发酵过程中显著提高了短链脂肪酸的含量。代谢组学分析表明主要的代谢途径包括葡萄糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢。
在过去的几十年里，功能性寡糖的重要性得到了显著的提升，因为它们具有促进人类健康和提高动物营养的潜力，如预防结肠癌的发生，降低血糖水平，具有抗氧化活性，抗肥胖，增强免疫系统防御，修复肠道屏障损伤目前，功能性寡糖的工业生产主要依靠单糖合成和/或多糖降解方法。传统的降解方法，如化学降解和物理降解，存在产生副产物、目标产物收率低、操作复杂、环境污染大等缺点。近年来，许多功能性寡糖都是通过酶降解方法生产的，具有产率高、对环境影响小、反应条件温和、副产物生成少等优点。白酒是中国的国酒，是通过固态发酵过程生产的，它会产生一种棕黄色的粘稠液体，叫做Huangshui(HS)。HS一般收集在发酵酒窖的底部，富含有机酸、单宁、可溶性淀粉、蛋白质和还原糖。由于其潜在的健康益处，研究人员对HS的兴趣越来越大，特别是其高浓度的多糖，这正是制备寡糖的极好来源。虽然以前的研究已经证明了HS多糖(HSPs)具有抗氧化、免疫调节和肠道屏障保护作用，但目前对HSPs衍生的寡糖的研究还很缺乏。肠道是营养物质消化和吸收的关键部位，大约有500-1000种微生物，包括厚壁菌门和拟杆菌门，它们是人类肠道微生物群的主要组成部分肠道菌群在维持肠道微生态系统平衡，促进宿主健康方面起着至关重要的作用。肠道菌群产生的代谢物，如短链脂肪酸(SCFAs)和吲哚，作为肠道菌群的“信使”，影响宿主的食欲、炎症反应和内分泌功能，最终调节宿主的代谢活动目前的研究表明，食物中不可消化的成分会影响宿主肠道微生物群的组成和活性，从而影响宿主的健康和身体机能尽管如此，目前还没有关于HS寡糖(HSOs)这种不可消化物质的肠道益生菌特性的信息。基于以上事实，本研究旨在利用酶解法从HS中获得一种新型寡糖，并利用多种方法对其进行结构分析。随后，通过体外发酵检测微生物群落结构、短链脂肪酸含量和代谢的变化，研究寡糖对肠道微生物的有益作用。本研究不仅为探讨HSO与肠道健康的关系提供了参考，也为提高Huangshui的高值化利用提供了思路。
在进行单因素实验之前，对酶型进行了优化。综上所述，选择α-淀粉酶与果胶酶比例为1:1的方案，其cHSO产率最高，为26.80±2.11%。pH、酶用量、温度范围对cHSO酶解产率的影响分别如图S2A−C所示，且各参数对酶解产率均有显著影响。保证最高产率的最佳单因素为pH 6.0、酶加量100 μL、酶解温度55℃。变量设计和响应值如表S2所示。三个提取变量与HSO得率的关系为Y=27.26−1.22A+2.91B−6.30C+0.32AB−1.58AC+0.87BC−3.39A2−2.62B2−4.75 5c2，其中Y为寡糖得率，A、B、C分别为pH、酶加量和酶解温度。统计分析显示，所选模型具有显著性差异(p < 0.01)，表明具有高度的差异性，如表S3所示。模型内的拟合缺失项没有统计学意义(p = 0.1066 > 0.05)，表明拟合水平令人满意。计算相关系数R2为98.47%，调整后R2为96.49%。这些值表明彼此相当接近，进一步证实了模型的准确性具体讨论请参见支持信息中的2.2节。根据二阶多项式方程，最佳提取条件为pH 5.99，酶投加量111 μL，提取温度51.9℃。在最优条件下，实际cHSO得率为27.01±0.99%，与预测的提取率(29.88%)非常接近，高于以长牡蛎多糖为原料的低聚长牡蛎多糖的提取率。本研究的重点是DEAE-52的水洗脱部分，如图1A所示，这部分占比最高，为46.7%，用Sephadex G15进一步纯化(图1B)，去离子水作为洗脱剂。计算得到HSO的分子量为1791 Da(图1C)，有一个主峰，表明它是一个均相馏分。分散指数(PD)为1.7 Mw/Mn，表明HSO在组成上是一种相对均匀的寡糖单糖组成分析显示，HSO主要由葡萄糖组成(95.41%)，如图1D所示，其单糖组成与原cHSP相同，cHSP是酶解的原料。![]()
图1. DEAE-52柱的初始纯化过程(a)， Sephadex G-15柱的进一步纯化过程(B)， HSO的HPGPC谱图(C)，单糖组成(D)和FT-IR光谱(E)。
HSO的FT-IR光谱如图1E所示。在3373 cm−1附近观察到的宽而强的峰对应于寡糖结构中分子间或分子内O−H键的拉伸振动2932 cm−1附近的峰是烃基的C−H伸缩振动吸收峰这两个峰是碳水化合物的重要特征吸收峰。在1645 cm−1处的吸收峰表明存在复杂的碳水化合物性质在1417和1363 cm−1处观察到的吸收峰代表CH和CH2基团的角畸变此外，1052、1082和1024 cm−1处的三个吸收峰对应于吡喃环的拉伸振动，表明HSO属于吡喃糖类。此外，848 cm−1处的吸收峰表明糖链中存在α构型此外，没有与葡萄糖醛酸和硫酸基团相关的特征吸收峰，这表明HSO是中性糖，这与单糖组成的结果一致。利用扫描电镜和原子力显微镜技术研究了寡糖的形态HSO的SEM结果如图2A所示。图像清楚地显示HSO内存在两个不同的结构。其中一种结构呈现出光滑表面的片状形态(左图)，而另一种结构则呈现出交织在一起的细丝状球形结构(右图)。与cHSP不同的是，cHSP呈现不规则的片层形态，表面粗糙不平。以前曾报道过从厚根菌根中提取的多糖的类似微观结构此外，通过元素分析，在放大的特异性缠绕细丝上检测到C(原子%:55.91%)、O(原子%:43.67%)和Na(原子%:0.42%)3种元素(图2B)，表明HSO纯度高，化学污染物较少。AFM结果如图2C所示。在HSO的结构中观察到许多大小在0.4−2.5 nm之间，直径在10−200 nm之间的球形团块，这表明HSO在水中分散后发生了聚集。这可能归因于分子间的缠结和寡糖链聚集体的形成。![]()
图2. HSO的形态特征:SEM图像(A)， x射线能谱图像(B)， AFM平面图像和三维图像(C)， HSO的粒度分布(D)。
HSO的粒径分布如图2D所示。可以观察到，HSO的平均粒径分布范围在0.03−0.20 μm之间，这可能是由于HSO的分子间和分子内羟基相互作用所致。此外，水中连续的布朗运动导致溶剂和碳水化合物分子之间不断的碰撞和接触，从而导致聚集。HSO的糖苷键结果见表1。此外，甲基化产物的FTIR光谱(图S3)显示羟基完全被2.3节中讨论的甲氧基取代，主要由2,3,6-三-O-甲基葡萄糖醇组成，占总衍生物的42.61%，表明HSO的一级链由1,4连接的葡萄糖单元组成。2,3,4,6-四邻甲基葡萄糖醇占总衍生物的30.86%，表明HSO中存在更多的支链。2,3,4-3-O-甲基葡萄糖醇和2,3-2-O-甲基葡萄糖醇分别占9.34%和17.18%，表明HSO链中存在1,6-糖苷键和1,4,6-糖苷键。表1. HSO中的糖苷键
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HSO的核磁共振谱图如图3所示，表2列出了HSO在D2O (ppm)中的1h和13C核磁共振化学位移分配。对这些结果的详细分析和讨论在支撑资料的2.4节中进行。基于一维和二维核磁共振数据和糖苷键，HSO的初步结构可以描述为一种葡聚糖寡糖，主链由→4)-α- D-Glcp-(1→组成。此外，在6位上，→6)-α-D-Glcp -(1→和α-D-Glcp-(1→连接出现分支。甲基化分析结果表明，→4)-α-D-Glcp-(1→，→4,6)-α-D-Glcp-(1→，→6)-α-D-Glcp-(1→)的比例约为4:2:1。考虑到HSO的分子量，在图3H中假设可能的结构为聚合度(DP)值为11的新结构。![]()
图3. HSO的核磁共振谱:(A) 1h， (B) 13C， (C) HSQC， (D) DEPT 135， (E) 1h−1h COSY， (F) NOESY， (G) HMBC， (H) HSO可能的结构图。残基解释:A，→4)-α-D-Glcp-(1→;A '，→4)-α-D-Glcp -(1→;B，→4,6)-α-D-Glcp-(1→;C，→6)-α-D-Glcp -(1→;D， α-D-Glcp-(1→;Rα→4)-α-D-Glcp;Rβ→4)-β-D-Glcp。
表2. HSO在D2O (ppm)中的1h和13C核磁共振化学位移分配
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肠道菌群是一个复杂的微生物生态系统，广泛参与机体的多种生理功能，其结构和排列反映了微生物与宿主之间的互利共生进化近年来16S rRNA基因测序技术的进步，使得利用肠道微生物研究肠道疾病和探索肠道与机体健康的关系变得更加可行在肠道菌群发酵前，进行了唾液、胃和小肠条件下HSO的体外模拟消化。如图S4所示，HSO不能被唾液、模拟胃和小肠分解；因此，HSO可以安全到达肠道并与肠道菌群相互作用。采用Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数和Coverage指数对HSO诱导的微生物群落结构α-多样性进行评价。如图S5A所示，与空白组相比，HSO的Chao和Ace指数明显升高(p<0.05)。然而，Shannon指数和Simpson指数没有显著差异。覆盖指数(图S5A)超过0.99，说明样本的测序深度是足够的。α-多样性分析表明，HSO显著提高了肠道菌群的丰富度和多样性。基于Bray−Curtis聚类树，β-多样性分析的PCoA和非度量多维尺度(NMDS)结果如图S5B所示。值得注意的是，空白组、HSO组和菊粉组肠道菌群的分布呈现出明显的分离，这表明HSO引起了肠道微生物群落组成的实质性改变，类似于菊粉的作用。为了可视化肠道微生物群落的相似性和重叠连接，采用了维恩图。与空白组和菊粉组相比，HSO组的OTUs总数增加。如图4A所示，对不同额外碳源孵育的粪便微生物群进行发酵48小时后，评估了门水平群落的相对微生物丰度。空白组以厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为主。与空白相比，菊粉组降低了厚壁菌门和放线菌门的相对丰度，但略微提高了拟杆菌门和变形菌门的相对丰度。此外，值得注意的是，与菊粉和空白组相比，HSO组在拟杆菌门和放线菌门的相对丰度上显着提高，而厚壁菌门的相对丰度则明显降低。早期的研究表明，拟杆菌可以编码糖苷酶和多种碳水化合物水解酶，将不可消化的糖分解成短链脂肪酸此外，拟杆菌群产生的代谢物可以被其他肠道微生物利用HSO组中与放线菌群的竞争可能是厚壁菌门丰度下降的原因。此外，研究表明拟杆菌门和厚壁菌门的比例与人类肥胖和胰岛素抵抗之间存在相关性HSO组显著提高了这一比例，表明其具有潜在的抗肥胖作用。放线菌属是革兰氏阳性菌，其中双歧杆菌属是具有代表性的同质菌属，被认为是肠道中最有益的益生菌之一，HSO组放线菌属的升高可能是由于丁酸含量的增加所致在菊粉组中，拟杆菌群并没有明显增加，这可能是由于厚壁菌门产生了更多的丁酸，从而降低了pH值，抑制了拟杆菌群的生长。在目前的研究中，菊粉组与空白组和HSO组相比，梭杆菌群的相对丰度较低。这一发现很重要，因为梭杆菌与胃肿瘤的发展有关同样值得注意的是，变形菌群在三组之间没有表现出任何显著的差异。综上所述，HSO能够调节肠道菌群的组成和丰度，从而促进有益细菌的生长。![]()
图4. 门水平(A)和属水平(B)细菌群落的相对丰度。根据Welch’s t检验，Blank组与HSO组(C)和HSO组与Inulin组(D)的差异属。属水平上细菌群落相对丰度的热图分析(E)。由LEfSe分析得到的分类谱系图(F).空白，空白对照(未额外补充碳源);阳性对照菊粉(补充菊粉);HSO，试验组(HSO补充)
属水平的肠道微生物组成如图4B所示，HSO、Blank、Inulin组的属水平差异如图4C、D所示。空白组的优势菌群包括志贺氏杆菌、小芽胞杆菌、phascolartobacterium等。与空白组相比，HSO组显著促进了Phascolarctobacterium、Bifidobacterium、Bacteroides、Megasphaera和Cloacibacillus。Phascolarctobacterium是一种重要的细菌，它能产生醋酸盐和丙酸盐，并与人类的好心情有关此外，拟杆菌可以预防直肠癌和炎症，改善代谢紊乱，调节肥胖个体的免疫功能双歧杆菌是肠道中重要的益生菌之一，具有调节肠道疾病、调节免疫系统、抗肿瘤等作用，对人体健康有益。同时，HSO组显著降低了有害细菌的相对丰度，如Paeniclostridium。相比之下，菊粉组肠球菌和梭菌的丰度较高，梭菌的丰度较低。梭杆菌可能与胃肿瘤的发生有关，有人在研究动态利用菊粉对肠道微生物群的影响时同样发现菊粉可以上调肠球菌的相对丰度，这可能在微生物的碳水化合物代谢中起关键作用。HSO和菊粉类群中志贺氏杆菌的比例较高可能是由于其利用低分子量碳源来维持其生长因此，结果表明，HSO组的优势菌群与菊粉组不同，说明它们具有不同的益生菌特性。综上所述，HSO通过调节肠道菌群的组成，促进有益菌的生长，同时抑制有害菌的定植，表现出潜在的益生特性。此外，图4E中的热图显示了Blank、HSO和Inulin组中在属水平上排名前30的细菌物种的相对丰度。HSO组的优势菌群为巨球菌属、Bacteroides、Bifidobacterium、Allisonella、Blautia菌、Cloacibacillus、Parabacteroides，Inulin组的优势菌群为巨球菌属、Enterococcus、Clostridium _ sensu _ stricto _ 1、Paeniclostridium等。这些结果表明，HSO和Inulin作为额外的碳源，在体外发酵过程中对肠道微生物的组成和丰度产生了积极的影响。线性判别分析效应量( LEfSe )分析是一种用于识别人群间具有统计学差异的生物标志物并对结果进行解释的统计学方法。本研究采用LEf Se分析，log LDA得分阈值为4，以识别不同进化水位下群体的判别特征。图4F显示，HSO组增加了双歧杆菌属(Bifidobacterium)，并富集了人体肠道中主要利用多糖的拟杆菌门(Bacteroidota spp.)。如图S6所示，Blank、HSO和Inulin组分别有13、24和11个优势菌落，差异具有统计学意义。这表明HSO培养基对调节肠道微生物组成有显著作用。肠道微生物的代谢物在连接膳食纤维与宿主之间起着重要作用短链脂肪酸(SCFAs)是肠道菌群发酵寡糖、非淀粉多糖、抗性淀粉等膳食纤维产生的代谢物，主要包括乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸等研究表明，短链脂肪酸具有维持肠道健康、调节免疫系统、促进脂溶代谢和调节能量代谢等作用因此，SCFAs的测定是评价碳水化合物体外发酵行为的重要指标。Blank组、HSO组和Inulin组发酵过程中不同时间点不同种类SCFAs的水平如表3所示。显然，由于乙酸、丙酸和丁酸在含量上的优势，它们是发酵的主要产物。发酵48 h后，HSO组乙酸水平上升至9.64 ± 0.16 mmol/L，显著高于Blank组(6.23±0.27 mmol/L , p<0.05)，略低于Inulin组(10.95±1.12mmol/L)。丙酸在体内脂质代谢中起着关键作用，能够降低肝脏和血浆中的脂肪酸水平，减少食物摄入。发酵48 h后，Blank、HSO和Inulin组丙酸水平分别为1.54±0.30、4.84±0.11和4.18±0.42 mmol/L，HSO组显著高于Inulin组和Blank组(p<0.05)。据报道，丙酸的产生可能与拟杆菌属(Bacteroides)和考拉杆菌属( Phascolarctobacterium)有关，这也很好地解释了本研究中肠道微生物组成的结果。发酵48 h后，HSO组丁酸含量为5.34 ± 0.61 mmol/L，显著高于Blank组(2.63±0.25 mmol/L , p<0.05)，与Inulin组(5.49±0.58 mmol/L)差异不显著。丁酸能够调节宿主基因、细胞分化和凋亡，是结肠上皮细胞的主要能量来源。在本实验中，放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)可能是丁酸的主要生产者。表3. 体外发酵液培养0、6、12、24和48 h后短链脂肪酸浓度的变化
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随着发酵的进行，各组总scfa含量均有所增加。值得注意的是，HSO组的SCFAs在发酵6 h后显著增加，这与Miao等人研究α- d -葡聚糖发酵特性的结果相似，同时他们也得出低分子量葡聚糖可能是有益菌生长的最佳底物的结论发酵48 h后，HSO组总SCFAs水平达到23.33±0.41 mmol/L，显著高于空白组(13.00±0.50 mmol/L, p < 0.05)，与菊粉组(24.30±0.27)差异不显著。这些结果表明，HSO可以促进SCFAs的产生，以维持肠道健康。微生物代谢是肠道微生物群与宿主之间的信号通路，在宿主健康中起着关键的调节作用。在本研究中，在正离子模式下共检测到1017种代谢物，而在负离子模式下检测到712种代谢物。然后使用Ropls (R包，版本1.6.2)对提取的数据进行分析。PLS-DA评分图(图5A,B)清楚地描绘了三个试验组之间的明显界限，表明HSO诱导的肠道微生物群代谢的改变类似于菊粉的影响。此外，火山图(VIP > 1, p < 0.05)显示空白组和HSO组之间存在显著差异，如图5C,D所示。利用KEGG数据库，将鉴定出的差异代谢物导入Scipy (Python, version 1.0.0)软件进行进一步分析。随后使用Benjamini-Hochberg方法调整p值。采用p < 0.05的显著性阈值表示这些通路显著富集。如图5E所示，差异代谢物主要参与与氨基酸代谢和糖代谢过程相关的途径。![]()
图5. 正离子模式(A)和负离子模式(B)下的Score (PLS-DA)图。正离子模式(C)和负离子模式(D)下HSO组和Blank组代谢物的Volcano图(VIP > 1, p < 0.05)。路径富集的拓扑分析进行KEGG数据库(E)。15种代谢物与20种差异属的Spearman相关性热图(F)。
为了更好地了解肠道微生物群与差异代谢物之间的相互作用，我们对最关键的15种差异代谢物和20种细菌属进行了Spearman相关分析。如图5F所示，拟杆菌、拟副杆菌和双歧杆菌等细菌上调4-羟基- l-脯氨酸、琥珀酸、柠檬酸、5-氨基戊酸、γ-氨基丁酸和2-羟基丁酸等代谢物，相反下调脯氨酸-羟基脯氨酸、N-甲基- l-苏氨酸和脯氨酸甜菜碱。此外，琥珀酸、柠檬酸和γ-氨基丁酸与Blautia属的丰度呈正相关，而与Paeniclostridium、Megamonas和Sellimonas菌株的丰度呈负相关。值得注意的是，它们是三羧酸循环代谢中至关重要的中间产物。同时，2-羟基丁酸参与糖异生途径，γ-氨基丁酸是参与丁酸代谢和氨基酸代谢等多种代谢途径的关键代谢物。由此可见，HSO通过调节肠道菌群组成，从而影响体内葡萄糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多种代谢途径，对宿主健康产生有益影响。
综上所述，本研究首次成功制备并表征了α-D-葡聚糖寡糖HSO，拓展了Huangshui的高价值利用。微生物组学和代谢组学分析结果表明，HSO可以作为一种功能因子，通过促进肠道健康来改善人类健康。此外，未来的研究重点将是探索不同类型的Huangshui寡糖与微生物发酵特性的构效关系，以及分析Huangshui寡糖的其他生物活性及其机制。
原文：Preparation, Structural Analysis, and Intestinal Probiotic Properties of a Novel Oligosaccharide from Enzymatic Degradation of Huangshui PolysaccharideDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c05666
