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奥希替尼，是临床上广泛应用的、针对EGFR突变的三代靶向药。关于这个药，目前已经有非常多的循证医学证据，其疗效可靠，无需赘述。目前的主要困扰，来自其耐药问题，于是，今天我们精心挑选了一个最新的前沿综述，予以翻译解读，希望这种方式，可以帮助大家更好地理解奥希替尼的获得性耐药问题。![]()
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摘要——Abstract
奥希替尼 (AZD9291) 是一种不可逆的第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI)，用于治疗 IV 期 EGFR 突变的非小细胞肺癌。它最初设计用于针对 EGFR 激活突变和 EGFR T790M 突变，这是第一代和第二代 EGFR-TKI 最常见的耐药机制。 FLAURA 试验之后，奥希替尼现已广泛用于一线治疗。然而，奥希替尼不可避免地会产生耐药性，导致其耐药的机制有多种，主要分为两大类：EGFR依赖性机制和EGFR非依赖性机制。 EGFR 依赖性机制主要包括 C797S EGFR 突变，而 EGFR 独立机制包括旁路途径、致癌融合和表型转化等。本综述总结了奥希替尼的分子耐药机制，旨在确定克服奥希替尼耐药并改善患者预后的新治疗方法。![]()
背景介绍——Background
EGFR激活突变存在于 15% 的白人和近 50% 的亚洲晚期 NSCLC 个体中，其中，外显子 19 缺失或外显子 21 L858R 点突变约占这些改变的 90%。小分子靶向药的开发，极大地改善了这部分肺癌群体的治疗效果。第一代（吉非替尼、厄洛替尼）和第二代（阿法替尼、达克替尼）TKI 在治疗 EGFR 突变的转移性 NSCLC 中始终显示出高效能。然而，EGFR 基因20号外显子中的T790M 突变导致了约 60-70% 的耐药性肿瘤。奥希替尼是第三代 EGFR-TKI，除了常见的 EGFR敏感突变外，还针对 T790M 突变，可延长第一代或第二代 EGFR-TKI 耐药后患者的生存期。2018年，FLAURA试验也显示，与第一代EGFR-TKI相比，奥希替尼作为一线治疗的生存率更高[8]。然而，尽管反应率很高，但奥希替尼不可避免地会产生耐药性。本综述总结了奥希替尼的耐药机制，为寻找奥希替尼耐药后的新治疗策略以及改善患者的治疗和结果奠定了基础。![]()
奥希替尼耐药机制
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶受体 ERBB 家族的一部分。这些受体的结构，由三大组件组成，包括一个处于细胞质中的含有络氨酸激酶的结构域、一个疏水的跨膜区域、以及一个细胞外结构域。EGFR 在许多癌症中频繁突变或过度表达，导致其激活，从而导致细胞生长、增殖、抑制凋亡。![]()
奥希替尼是一种单苯胺基嘧啶化合物，通过不可逆地抑制 EGFR 激酶结构域（细胞内区域）和 T790M 突变发挥作用。尽管临床效果优异，但依然面对耐药困难。下图概括了目前EGFR靶向药治疗背景下的获得性耐药机制。奥希替尼的耐药机制分为两个不同的类别：EGFR依赖性机制和EGFR非依赖性机制。 在前者， C797S 突变被发现是最常见的；而在后者，则包括了旁路信号的发展、组织学转化和致癌融合以及本综述中引用的其他机制。![]()
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EGFR依赖性耐药机制
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上表给大家总结了各种EGFR依赖性耐药机制，后续将进行一一解析。首先，C797是奥希替尼最常见的获得性耐药机制，要更好地理解这个问题，我们需要知道奥希替尼发挥作用的基本模式。就是，奥希替尼通过结合EGFR细胞质内的络氨酸激酶结构域，形成不可逆的共价键，从而发挥作用，而这个结合位点，恰好就位于C797残基上。所以，一旦发生C797位点突变，就会影像奥希替尼正常结合，从而难以发挥作用。![]()
所谓顺式，就是C797和T790M的突变，位于同一条染色体上，而所谓反式，就是C797和T790M的突变，位于不同的染色体上。从现有数据来看，如果是反式联合突变，那采取第一代和第三代的联合治疗策略还是有效的，但是如果是顺式联合突变，那整体治疗难度将会明显增加，这背后可能是同一染色体两个突变状态下，所产生的EGFR结构域不利于靶向药结合的缘故。现有证据表明，C797S更多见于那些接受二线奥希替尼的患者中，并在EGFR 19外显子缺失群体更为常见。相比C797S，C797G突变则更为少见，但也有关于它导致奥希替尼耐药的研究报道，其底层逻辑依然是突变带来C797残基结构改变，影响奥希替尼有效结合。L718残基位于EGFR激酶结构域ATP结合位点的P环内，该位置的突变可能带来空间限制，从而影响奥希替尼的正常结合，赋予耐药性。L718Q是该位点最常见的突变类型，占奥希替尼耐药的7.3%~9.7%，它大多在没有C797突变的情况下发生，表明仅靠本身就可以导致强烈的奥希替尼耐药问题。G719突变也被发现可能带来奥希替尼耐药，由于G719位点靠近L718位点，因此其背后的耐药机制可能与L718相近。研究报道显示，L792位点突变可能导致奥希替尼轻度和中度耐药，其中，L792H是最强和最常见的突变亚型。
从理论上来看，L792突变会在空间上干扰奥希替尼苯环上的甲氧基，从而阻碍奥希替尼与激酶结构域的结合。常见的L792突变包括L792H、L792F、L792Y、L792P、L792Q、L792V。奥希替尼与EGFR的共晶结构显示EGFR G796位于奥希替尼的苯基芳环下方。所以，G796位点突变被认为会影响奥希替尼芳香环功能，从而阻碍奥希替尼与激酶结构域的结合。常见的突变位点包括：G796S、G796R和G796D。G724 位点位于 EGFR 激酶的 ATP 结合区域。因此，像 G724S 这样的突变可能会通过蛋白质结构改变或ATP 亲和力增加而导致奥希替尼耐药，比较多见于EGFR 19外显子缺失的患者。其他在文献中报道过可能导致奥希替尼耐药的EGFR依赖突变，还有L798I、L844V、L692V、E709K、V802I/F、V834L、E758D、F712L、T854A、V843I、V726M、G824D、L747P和S768I。EGFR 基因扩增在许多情况下被描述为奥希替尼的一种合理耐药机制，在过去的一项研究中，EGFR扩增是二线奥希替尼治疗中非常常见的耐药机制。此外，HSP90抑制剂被证明可以降低EGFR扩增诱导的耐药现象。由于奥希替尼是一种特异性抑制T790M突变的靶向药，因此，T790M表达缺失或减少都会诱导奥希替尼耐药。T790M 的缺失已在许多奥希替尼耐药病例中得到描述，并且经常与其他耐药机制相关，因此，目前关于其单独发生是否可以导致奥希替尼耐药的问题，依然存在一定的争议。但从现有数据来看，相比于T790M突变患者而言，T790M缺失患者治疗效果更差、生存率更低。![]()
EGFR非依赖性耐药机制
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间充质上皮转化 (MET) 蛋白是由MET基因编码并在各种细胞膜表面上进行表达，是一种单通道酪氨酸激酶受体。一旦肝细胞生长因子（HGF）与 MET 蛋白结合，就会触发一系列细胞内信号并介导细胞分化、增殖和血管生成。
由于MET是一种原癌基因，HGF/MET轴的过度激活会加速多种癌症的发生和扩散，包括肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌等。
事实上，MET基因突变、过度表达和扩增都可以通过激活多种下游信号通路加速肿瘤生长和进展，比如PI3K/AKT、Ras/MAPK、JAK/STAT、SRC和Wnt/ -连环蛋白。由于MET信号通路通过上述信号通路提供了旁路机制，因此它也与EGFR网络密切相关。
除了 T790M 突变的出现外，MET（或 cMET）基因扩增（基因拷贝数增加）长期以来被认为是第一代或第二代 EGFR-TKI 的重要耐药机制。然而，最近的临床前和临床研究表明，MET 改变（例如扩增和/或蛋白质过度表达）也是对第三代 EGFR-TKI（如奥希替尼）获得性耐药的一个主要因素，尤其是作为一线治疗时。事实上，当奥希替尼用作一线治疗时，MET 扩增是最常见的耐药机制，通过NGS检测可以发现有15%的耐药患者会出现这种情况。事实上，MET扩增可能通过触发 ErbB3 的 EGFR 独立磷酸化和 PI3K/AKT 通路的下游激活，在 EGFR 抑制剂存在时充当旁路机制，从而导致 EGFR-TKI 耐药性。因此，MET 扩增被认为是 EGFR非依赖性耐药的最常见原因，其出现独立于T790M突变之外，换言之，不论在T790M阴性还是阳性患者中，都有可能出现MET扩增现象。除了 MET 扩增之外，获得性 MET 突变也被证明会引发奥希替尼耐药，尽管其发生几率低相比MET扩增更低。其中，比较值得关注的是MET 外显子 14 跳跃突变 (METex14)，这个突变会引发剪接转录、MET降解减少并通路激活的结果。按现有认知，关于奥希替尼引发MET跳突的可能解释更多是从肿瘤异质性出发来理解，即肺癌混杂体在治疗初期即携带MET跳突亚群，而后者对奥希替尼治疗不敏感，因此在药物筛选下得以存活发展成为主要克隆。人表皮生长因子受体 2 (HER2) 是一种由 ERBB2（一种已知的原癌基因）编码的酪氨酸激酶受体。在二聚化状态下，它可以激活多种促进细胞活力和侵袭的内在途径，包括 MAPK 和 PI3K/AKT 途径。
关于HER2改变激活肿瘤发生发展的结果早有报道，包括乳腺癌、卵巢癌和胃癌等。
大量研究发现， HER2 扩增（amplification）是奥希替尼的主要耐药机制之一，占据一线耐药2%、二线耐药5%的发生率。
除此之外，HER2的其他装变也可能导致奥希替尼耐药发生，比如HER2的16外显子跳跃突变，比如HER2外显子的20插入突变。
KRAS是由KRAS基因编码的癌基因，是KRAS/MAPK通路（又称Ras-Raf-MEK-ERK通路）的一部分，在细胞周期进入和增殖的调节中发挥重要作用。理论而言，这个信号通路的任何蛋白质发生突变，都可能导致细胞生长不受控制，从而导致肿瘤发生发展。KRAS突变中，比较常见的是KRAS G12X突变，包括G12V、G12D、G12S、G12A等。这些突变的存在被认为可能会导致奥希替尼耐药。背后的潜在解释是，奥希替尼抑制了EGFR相关性生长信号通路杀灭肿瘤细胞，这个过程被激活的KRAS乃至下游信号通路所逆转（因为KRAS/MAPK信号通路可能诱导肿瘤生长）。除此之外，有研究表明，KRAS扩增可能也会带来奥希替尼耐药。NRAS：NRAS 是另一种 GTP 酶，与 KRAS 相关，也调节细胞的生长和增殖。NSCLC中报道的NRAS激活比例<1%。现有数据显示，NRAS E63K或NRAS Q61K可以通过相同的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路激活MEK和ERK，导致奥希替尼耐药。NRAS拷贝数增加或mRNA过表达也可以导致类似的现象。BRAF：BRAF 是在上述 EGFR/RAS/RAF 通路中 RAS 下游发现的激酶，BRAF突变大约鉴于3%-4%的肺部肿瘤中。但是，BRAF突变在EGFR突变的NSCLC中很少出现，但依然有少数的报道显示在EGFR-TKI之首，患者会因为获得性BRAF突变而出现疾病进展，其背后的潜在机制可能也是通过激活EGFR/RAS/RAF通路实现的。在各种突变中，获得性BRAF V600E发生率大概在50%左右，诱导大概3%的奥希替尼耐药现象，不论在一线/二线应用，也不论是否合并T790M突变。其他少见的BRAF突变,包括BRAF G469A、D549G、G466R、G467A/V以及V600F，都有报道和奥希替尼耐药有关。ERK：许多细胞外刺激和细胞内过程都会激活 ERK（细胞外信号调节激酶）。这个级联放大反应一旦激活，将显著地激活启动细胞生长、分化和发育过程。奥希替尼耐药细胞的体外分析显示，尽管EGFR磷酸化受抑制，而ERK磷酸化则持续存在，暗示激活状态的ERK信号通路诱导了奥希替尼耐药现象。WNK 激酶，也称为凋亡抑制剂，参与促进细胞增殖的调控。 WNK1 活化增加可能是维持 ERK 活化的一种机。 这些发现表明，不论对一线/二线奥希替尼治疗患者而言，RAS-MAPK都是引发奥希替尼耐药的关键机制。PI3K/AKT/mTOR 信号系统控制着多种细胞功能，包括生存、增殖、生长、代谢、血管生成和转移，其表达改变或功能激活在多种癌症中均有报道。许多上游信号蛋白控制PI3K/AKT/mTOR通路，并且它还参与许多补偿信号网络，特别是前面提到的RAF/MEK/ERK通路合作，控制许多下游效应器。
这些突变可引起组成型 PI3K 活性、AKT 磷酸化和下游 mTORC1 信号通路激活，所有这些都是细胞生存和增殖所必需的。这导致 PI3K 信号传导增加，诱导癌症发生发展。
现有数据显示，在奥希替尼耐药的患者中，出现PIK3CA突变是非常普遍的。比如，有一项研究就指出，在26名具有非 EGFR 耐药机制的个体中，10 名患者存在 PI3K-AKT-mTOR 信号相关的基因组变化，其中 6 例存在 PIK3CA 功能获得性突变。在奥希替尼治疗前接受第一代 EGFR-TKI 治疗的患者中，高达 10% 存在 PIK3CA 突变（E545K、E542K），而在奥希替尼治疗前未接受治疗的患者中，有 7% 存在这些突变。E545K、E542K、R88Q、N345K 和 E418K 的频率约为 4%-11%，属于已知的 PIK3CA 突变，已发现这些突变会对二线奥希替尼治疗产生耐药性。小细胞转化也与 PIK3CA 等基因突变有关。
上皮间质转化（EMT）是一个高度动态的过程，表现为上皮细胞失去极性和黏附力，转变为具有迁移能力的侵袭性间质表型。一般情况下，这个过程发生在正常胚胎发育、组织再生、器官纤维化和伤口愈合期间。但是，当EMT高度失调时，上皮间质转化可以在癌症的进展、发展和转移以及对细胞凋亡和抗癌药物的抵抗中发挥作用。已证明 EMT 在多种恶性肿瘤的肿瘤发生中发挥作用，包括前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和乳腺癌。对于转移性 NSCLC，EMT 可能是奥希替尼耐药的多种机制之一。一项研究表明，let-7c（一种靶向并抑制 WNT1 和 TCF-4 的关键肿瘤抑制 miRNA）的过度表达，可以通过逆转肺癌细胞中的 EMT 来增加对奥希替尼的敏感性，这说明了 EMT本身可能诱导奥希替尼耐药。另一项研究表明，在奥希替尼耐药细胞系中，E-钙粘蛋白（一种上皮标记物）下调，波形蛋白（一种间充质标记物）上调，并有ZEB1的过度表达（锌指 E 盒结合同源盒 1）（一种通过诱导 EMT 促进转移和肿瘤侵袭的转录因子）。以上关键因子，都是促进EMT的关键步骤。此外，发现与 EMT 和抗凋亡相关的锚蛋白重复结构域蛋白 1 (ANKRD1) 在奥希替尼耐药细胞中增加，而ANKRD1 敲低则可通过诱导肿瘤细胞凋亡克服奥希替尼耐药。一些耐药奥西替尼细胞在形态学上越来越趋近于球形，也支持EMT带来的耐药改变假说。事实上，在NSCLC群体中，诸多信号通路的激活都会导致EMT增强现象。比如，Snail作为一种转录因子，就在NSCLC中表达上调，并可以通过诱导EMT促进肿瘤迁移和侵袭性增加，同是也会导致奥希替尼耐药。细胞因子中包括 TGFβ 的三种亚型：TGFβ1、TGFβ2 和 TGFβ3，也可激活TGFβ 受体 -SMAD2/3 信号传导，从而诱导 EMT。有研究发现，在奥希替尼治疗期间，癌细胞会通过上调 TGFβ2，从而激活 SMAD2，导致 EMT 和对奥希替尼的耐药。外泌体 miRNA（一类小非编码 RNA 分子）作为 引发EMT以及获得性耐药的关键步骤已经逐渐得到阐述。事实上，一项实验研究表明，外泌体miR-210-3p可以直接促进EGFR突变NSCLC中的EMT现象，并诱导出对奥希替尼的耐药现象。因此，上皮向间质转化是一种普遍存在的获得性奥希替尼耐药机制。组织学转化可发生在多种类型的癌症中，并且在患者的预后和治疗反应中发挥着关键作用。非小细胞肺癌也可能出现这种情况。在服用奥希替尼的患者中观察到从 T790M 阳性腺癌向 T790M 阴性大细胞神经内分泌癌的转变，这种转变诱发了奥希替尼获得性耐药，属于一种脱靶机制。在使用奥希替尼等第三代 EGFR-TKI 作为一线或二线治疗后，已描述了从腺癌向小细胞肺癌 (SCLC) 的转化，而这种转变在一代TKI治疗患者中相对少见。先前的研究表明，小细胞转化与 EGFR 突变 NSCLC 患者的 RB1、TP53 和 PIK3CA 突变有关。当患者接受奥希替尼作为一线治疗时，从腺癌向鳞癌的组织学转化也同样有可能发生，因此，必须认识到接受奥希替尼治疗的 NSCLC 患者的组织学转变，因为它具有重要的预后和治疗意义。研究表明，癌基因融合是奥希替尼的另一种可能耐药机制，尤其是在二线治疗中，3%-10% 的患者会出现这种机制。这些融合包括 BRAF 基因中的融合，如 AGK-BRAF、ZDHHC20-BRAF、PCBP2-BRAF 或 ESYT2-BRA。间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 融合也被证明可能介导奥希替尼耐药性。它们包括 STRN-ALK、EML4-ALK、DCTN1-ALK 和 PLEKHA7-ALK。RET基因融合也可以通过激活 MAPK 和 PI3K 信号通路导致奥希替尼耐药。成纤维细胞生长因子 (FGF) 家族中 22 种高度保守的蛋白质与受体 (FGFR1-4) 发生独特的酪氨酸激酶相关相互作用。为了控制胚胎发生、器官发育和成体组织稳态，下游 FGF/FGFR 信号传导控制关键细胞活动，如增殖、分化、迁移和死亡，也包括药物耐药。据研究报道，FGFR1、FGFR2或 FGFR3的扩增是导致奥希替尼耐药的潜在机制。一名使用奥希替尼后病情进展的患者在随后的活检中表现出 FGFR 扩增，而EGFR T790M 克隆被消除。此外，体外研究表明，通过诱导FGF2表达可使 EGFR 突变型 NSCLC 对奥希替尼产生耐药性。AXL 是酪氨酸激酶受体家族的成员。研究表明，在奥希替尼耐药细胞中，AXL 表达增加，而 AXL 敲低则抑制这些细胞的生长。这证实了 AXL 上调可能通过激活多种途径（包括 AKT）导致对奥希替尼的耐药性。然而，目前尚无证据表明 AXL 过表达在体内获得性耐药性的形成中发挥作用。胰岛素样生长因子 1 受体 (IGF-1R) 是一种跨膜受体酪氨酸激酶，存在于多种癌细胞中，包括 NSCLC，与细胞存活和增殖密切相关。胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGFBP) 是一类蛋白分子，可作为胰岛素样生长因子 1 (IGF-1) 的转运蛋白，它们通过与IGF-1结合延长IGF-1的半衰期，并调节其与GIF-1R的结合能力。研究发现，IGFBP3是最常见的IGFBP亚型，它们的缺失会激活IGF-1R，而后者可能导致奥希替尼耐药，这种情况下，沉默IGF-1R基因则可重新恢复细胞对奥希替尼的敏感性。这些结果都表明，IGF-1/IGFBP 系统不仅是一种有效的耐药机制，而且可能成为未来有价值的治疗靶点。肿瘤蛋白 53 (Tumor Protein 53, TP53) 是癌症中最常见的突变基因之一，它编码 p53，这是一种参与控制细胞增殖、维持基因组完整性和抑制肿瘤的核酸蛋白。在 NSCLC 中，TP53 突变会干扰奥希替尼等治疗的疗效。一项研究表明，TP53 突变是奥希替尼一线或二线耐药患者中最常见的突变之一 。研究还表明，与野生型 TP53 患者相比，TP53 失活突变患者更容易在奥希替尼治疗中出现耐药现象，PFS更短。在一项回顾性研究中，观察到TP53失活患者对一线和二线奥希替尼均有耐药性的现象，并提示可能存在转化为小细胞肺癌的风险。一项研究发现，在对奥希替尼无反应的患者中，热点突变 TP53 R273C 可能是一种耐药机制。这种突变已被证实可以减少细胞凋亡，这可能是其诱导奥希替尼耐药性的机制 。BIM 被称为B细胞淋巴瘤2类似蛋白11，从属于Bcl-2蛋白家族，参与细胞凋亡的内在途径。BIM通过两点促进细胞信号传递，第一种是抑制促进生存的BCL-2蛋白功能，第二种是激活促进凋亡的BCL-2蛋白功能。现有数据表明，较低的 BIM 蛋白水平与 EGFR-TKI 耐药性有关，BIM 过表达是诱导EGFR靶向治疗下肺癌细胞凋亡的必要条件。BIM 缺失多态性在第三代 TKI 耐药性中的作用也正在阐明。一项研究发现，合并BIM缺失多态性的肺癌患者，往往在奥希替尼治疗后表现出更差的临床结局。细胞实验也发现，奥希替尼无法在那些携带BIM缺失突变的细胞中诱导凋亡现象。这些发现表明，在 EGFR 突变的 NSCLC 细胞中，一个或两个等位基因中存在 BIM 缺失多态性就足以诱导对奥希替尼的耐药性。报道显示，一名同时具有 EGFR T790M 突变和 BIM 缺失多态性的患者在接受奥希替尼治疗后预后不良且进展。该结果表明，BIM 缺失多态性可能对确定奥希替尼治疗后的 NSCLC 患者预后具有预后价值。![]()
写在最后
总之，尽管奥希替尼在一线或二线治疗中大大提高了 EGFR 突变 NSCLC 患者的生存率，但最大的挑战仍然是获得性耐药的出现。已阐明的耐药分子机制有多种，可能依赖于 EGFR，也可能独立于 EGFR。近年来，尽管奥希替尼在分子耐药性方面已经取得了一系列进展，但由于耐药的异质性和复杂性，我们还远未对完整的机制进行详尽的解释。因此，需要进行更多研究，以更好地了解奥希替尼的获得性耐药性、增强治疗选择并改善患者预后。然而，目前克服奥希替尼耐药的具体决策，还是高度依赖于每个患者的肿瘤基因特征，而在找到更加标准的方法之前，所有耐药的克服，都离不开每个具体病情的具体分析。由于对奥希替尼耐药现象充满好奇，我在繁忙的手术工作之余，花了几天时间，给大家翻译了这篇综述，也是给自己一个交代。现在奥希替尼耐药机制十分复杂，本人在临床工作和日常接诊中，时常碰到此类患者，尽管也有不少成功处理的案例，但失败的情况也不少见，在现有循证医学证据情况下，如何有效突破此类困境，其实仍然没有明确共识，今天的帖子，一方面是为了帮助自己系统地梳理一下这个话题的科学背景；另一方面，也是希望能由此开启克服靶向耐药的系统工作。希望这次的工作对大家有所帮助，文字虽晦涩难懂，但内容全是干货，大家可以收藏起来慢慢看。![]()
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