文献阅读丨基于已获批的糠酸莫米松药物比较 EMA 外用产品质量和等效性指南草案的讨论

健康 2024-11-09 15:43 上海

文献阅读丨基于已获批的糠酸莫米松药物比较 EMA 外用产品质量和等效性指南草案的讨论已发布:2024 年 7 月 12 日第 14 卷，第 2153–2169 页，（2024 年）

阿迪娜·艾希纳，叶海亚·姆雷斯塔尼，马丁·胡考夫，约翰内斯·沃尔拉布

摘要

介绍

如今，仿制外用产品的批准包括向原研企业展示基于临床试验的治疗等效性。为了促进这一程序，欧洲药品管理局 (EMA) 于 2018 年发布了一份关于外用产品质量和等效性的指南草案，其中包括有关新开发的仿制产品质量的要求参数以及实施疗效等效性测试的测试方案。

方法

到目前为止，尚无关于拟议测试条件的质量和证据的数据。在本研究中，我们根据 EMA 指南草案的条款对两种已获批准的外用产品进行了体外渗透测试 (IVPT)，这两种产品在审批过程中已证明具有治疗等效性。

结果

复杂的生物特征数据处理表明，无论是原研产品还是仿制药，所有皮肤切片都无法观察到体外等效性。此外，指南草案中提出的阴性对照的必要性也值得怀疑。从呈现的结果来看，有迹象表明，减少皮肤捐赠者的数量就足以在所有应用配方的比较中实现统计学上显著的等效性。这里，建议使用n = 7 个捐赠者，而不是 EMA 指南草案要求的n[Math Processing Error]≥ 12，同时降低生物多样性的程度。此外，为了获得正确的统计数据，建议使用更多独立重复（n > 2）。

结论

该生物等效性研究显示参数不足，应与EMA指南草案一起讨论。

简明语言摘要 (PLS)

如今，在欧洲，仿制药的审批需要进行临床试验，以向原研公司展示治疗等效性。为了促进这一耗时耗力的过程，欧洲药品管理局 (EMA) 于 2018 年发布了一份指南草案，提出了对应用于人体皮肤的药物进行等效性测试的测试方案。尽管该草案已发布 5 年多，但仍处于草案阶段；此外，到目前为止，还没有证据表明测试方案中的实验设置是否可以证明等效性。这项研究应尽可能接近地证明 EMA 体外渗透测试 (IVPT) 的测试方案，在两种已在审批过程中证明治疗等效性的授权外用产品上进行测试，以确定是否也可以通过这种药代动力学方法观察到它们的等效性。由于实验设置的原因，进行了渗透测试以调查药物在皮肤横截面上的扩散行为，而不是渗透过皮肤的药物量。据我们所知，这项研究是关于该主题的第一篇发表的作品。这里，所用制剂的生物等效性总体上未发现，这些制剂在批准期间对患者进行测试时是等效的。我们建议减少供体数量并增加重复次数，以实现更高的统计数据评估能力。此外，EMA 指南应考虑对药物作用位点的药物量进行评估。

关键摘要要点

为什么要进行这项研究？

EMA（欧洲药品管理局）关于外用药品质量和等效性的指南草案提出，例如，采用IVPT（体外渗透试验）来显示两种药物之间的生物等效性。

这包括比较参比制剂和新仿制药在体外人体皮肤上的扩散研究。

到目前为止，尚无证据证明该指南提出的IVPT 测试方案。

根据 EMA 指南草案，IVPT 测试方案已针对所提出的研究进行了调整。

从这项研究中我们学到了什么？

这里，两种已批准药物之间的等效性并未总具有统计学意义。

与 EMA 指南草案相比，对研究结果的讨论包括对捐赠者和重复数量进行合理的调整，并提出扩大有关药物渗透的方法测试方案。

介绍

如今，药品短缺以及药品开发和审批成本上升给全球医疗保健系统带来了困难。简化审批程序有助于减轻负担，即在审批过程中采用药代动力学方法证明新仿制药 (GEN) 与原产药 (ORG) 的治疗等效性 [1 ]，就像欧洲对速释口服剂型所采用的方法一样。这一问题的紧迫性也适用于其他应用，如外用药物。然而，人体皮肤结构复杂，不断更新，因此很难预测与活性药物成分 (API) 的药代动力学相互作用。此外，API 的药效学相互作用通常与同时使用的辅料有关，这使制剂变得复杂。为简化仿制外用药物的审批流程，欧洲药品管理局 (EMA) 于 2018 年发布了《外用产品质量和等效性指南草案》（以下简称为 EMA 指南草案） [ 2 ]，适用于皮肤、耳部和眼部的局部应用和作用外用药物。该指南规定，对于营销授权甚至批准后变更，可以通过药代动力学或药效学等效性试验确定 GEN 和 ORG 之间的生物等效性 (BE)。为此，它提供了测试方案，例如通过体外渗透试验 (IVPT)。这些试验在扩散池上进行，例如使用 Franz 模型在离体人体皮肤上进行。IVPT 是合适且廉价的模型，可用于生成关于对皮肤的局部影响（渗透）或 API 通过皮肤的扩散能力（渗透）的陈述 [ 3，4，5 ]。在后一种情况下，经典的 IVPT 考虑 API 在整个皮肤中的扩散，并且仅确定随时间渗透到扩散池受体室的应用 API 的比例。因此，对人体皮肤的研究很大程度上模拟了体内条件 [ 6 ]，尤其是天然屏障功能。因此，可比的 IVPT 显示出较高的体内-体外相关性 (IVIVC) [ 7 ] 也就不足为奇了。此外，IVPT 用于研究剂量相关的局部生物利用度，这比药效动力学血管收缩试验更敏感 [ 8 ]。尽管 IVPT 具有诸多优点，但尚未对 EMA 指南草案相应测试方案的证据进行审查。

本研究旨在确定给定的 IVPT 测试方案参数是否适合显示等效性。为此，选择了两种已经获批的药物（ORG 与 GEN），其扩展的药物和治疗等效性已在 GEN 产品的审批程序中得到证明 [9 ]，并根据 EMA 指南测试方案草案通过 IVPT 方法进行测试。对数据进行了统计评估，以讨论当前至少 12 名捐赠者和 2 个独立重复的数量，因为这些参数与其他指南相比最具争议，如后文所述。然而，由于所选 API 具有高亲脂性，因此它不会渗透。因此，进行 IVPT 来研究渗透性而不是确定渗透性，这使我们能够确定皮肤横截面上的 API 分布曲线。

方法

材料

在垂直 Franz 扩散池（SES GmbH，Bechenheim，德国）上使用全层皮肤样本（Biopredic International，法国 Saint Grégoire）采集全层皮肤样本（Biopredic International，法国 Saint Grégoire）。从每个供体收集了 18 个皮肤样本（3 种配方，3 个不同的终点，2 次重复）。ORG 产品为 Ecural ®软膏（MSD Sharp & Dohme GmbH，德国 Haar，Ch.-B. U013931），GEN 产品为 Momecutan ®软膏（Dermapharm AG，德国 Grünwald，Ch.-B. 05211804A），两者均含有 0.1% 的糠酸莫米松 (MMF) 作为 API。对于阴性对照，将 Ecural ®软膏与不含 API 的基质 [凡士林、2-甲基-2,4-戊二醇、白蜂蜡、纯净水、丙二醇单硬脂酸酯、磷酸 10%（pH 调节）] 以 1:1 的比例混合，最终 MMF 浓度为 0.0513%。乙腈 (ACN) 和水均购自 VWR（HiPerSolv Chromanorm，HPLC 级，VWR International SAS，法国 Rosny-sous-Bios）。

程序

为便于比较，维持了两次独立重复的所有条件。本非临床研究不是临床试验。没有患者接受治疗，但对市售的匿名皮肤样本（Biopredic International，法国圣格雷瓜尔）进行了药代动力学研究（马丁路德大学哈勒-维滕贝格医学院伦理委员会章程，自 2020 年 9 月 21 日起生效）。

皮肤完整性测试

通过使用 Corneometer ®和 Derma Unit SSC 3（德国科隆 Courage + Khazaka）设备测量皮肤水分含量，测试了用于吸收研究（Franz 扩散池模型）的冷冻保存皮肤的完整性。验收标准为渗透实验前 60-100 相对 Corneometer ®单位 (rCu) 和渗透实验后 40-80 rCu，所有皮肤样本均符合该标准。

渗透

将每种配方 (ORG、GEN、NEG) 20 毫克涂抹在皮肤表面 (= 9.95 mg MMF/cm², 32.0 °C ± 0.1 °C)，并在 30、100 或 300 分钟的相应终点后用湿巾 (KIMTECH Science 精密湿巾，Kimberly-Clark Europe Ltd.，英国萨里) 擦拭，这些终点是从一项试点研究中选择的 (参见补充材料)。从每个皮肤样本中取出三个穿孔器 (活检穿孔器 6.0 毫米，MDSS GmbH，德国汉诺威)，并用切片机 (CM 1950，Leica Biosystems GmbH，德国努斯洛赫) 水平切成九片。将各个皮肤切片[每 10 µm 1 片角质层 (SC)、每 15 µm 2 片活体表皮、每 5 × 40 µm 5 片真皮以及剩余厚度不确定的残端] 汇集并储存在 -20 °C 下直至提取。

萃取

将收集的皮肤切片与乙腈（ACN，HPLC 级，VWR International SAS，法国 Rosny-sous-Bios）混合，并在实验室振荡器（KS-15，Edmund Bühler GmbH，德国 Bodelshausen）上搅拌 24 小时。为了确定总回收率，对皮肤上残留的 API（= 湿巾，未渗透的 MMF 部分）、将皮肤放入 Franz 池的滤纱布（ReliaDiscTM 膜过滤器，直径 47 毫米，孔径 0.45 微米，Ahlstrom-Munksjö Germany GmbH，德国 Bärenstein）和受体溶液进行处理（纱布和受体总计：渗透的 MMF 部分）。将抹布和滤网放入装有 ACN 的试管中，在实验室振荡器上搅拌（24 小时），然后以 13,000 rpm 的速度离心 10 分钟，使用上清液进行 HPLC 分析。从所有扩散池的受体溶液中，分别在 40 °C 的氮气熏蒸下浓缩 1 毫升，并用 0.5 毫升 ACN 重新溶解。

定量

为进行定量分析，将 20 µl 的每种样品注入 HPLC-UV 装置（Agilent 1200 系列 HPLC 系统，安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉），使用 Reprosil C18 色谱柱 [30 °C，100A，5 µm，125 × 4 mm（Wicom GmbH，德国黑彭海姆），溶剂流速：1.0 ml/min，乙腈/水 70/30（V/V），压力：149 bar]。HPLC 方法的验证根据 ICH 指南 Q2 (R2) 关于分析程序验证的规定 [10 ] 进行。已证明可以从人体皮肤和湿巾中回收 MMF。两个重复样品的 MMF 浓度（µg/mol）在皮肤深度分布图中以几何平均值表示。

生物特征评估

对于关键研究数据的统计分析，使用了适用于 Windows 的 SAS 9.4（SAS Institute INC.，北卡罗来纳州卡里）。在该探索性分析中，特意使用了完整的 5% 显著性水平，并提供了未调整的 95% 置信限度。首先，利用数据得出 (1) ORG、GEN 和 NEG 的重复实验的几何平均值 [2 ]；(2) ORG、GEN 和 NEG的供体内部标准差，其中使用了对数转换值。此外，(3) 计算了 ORG 供体内部的变异系数 (CV) 以及 (4) 作为 CV 函数的生物等效性的接受区间，不同程度的变异导致不同的接受限度 [ 11 ]。针对不同变量/亚组组合进行生物等效性分析：测量值[亚组：重复 I (ORG_I、GEN_I、NEG_I)、重复 I (ORG_II、GEN_II、NEG_II)、平均重复 (几何平均值：ORG、GEN、NEG)、重复 I 和重复 II (混合模型中)]、终点 (30、100、300 分钟) 和皮肤深度 (10、25、40、240、440、640、840 和 1040 µm)。之后，“ORG vs. GEN”、“ORG vs. NEG”和“GEN vs. NEG”被用作生物等效性和不等效性基础配对分析的符号。这里，根据 EMA 指南草案使用了不等效性的概念，其定义为“如果比率的置信区间完全超出 80.00–125.00% 的区间”。[数学处理错误]SWR

针对所有配方和皮肤深度单独考虑所有实验终点，以提供相应皮肤区的生物等效性信息。对于等效性检验，指定了几何平均值和相应的 90％置信区间 (CI)。对于几何比，估计了 90％置信区间（假设测量值呈对数正态分布），并给出指南中的等效限值 80–125％和 69.84–143.19％ [2 ]。后者是根据计算出的 CV 值进行评估时的最大等效限值。如果两组之间平均配对差异的估计置信区间在这些等效限值内，则两组在统计上是等效的。ORG 与 GEN 的等效性检验分别针对重复 I 和 II、它们的几何平均值以及两个重复的混合模型进行，将供体和重复视为随机效应。为了评估所需的供体数量，我们根据每个终点、皮肤深度和样本量（n = 4 至n = 15）从n 个供体中抽取了 1000 个随机样本（等概率且可替换），并进行了引导。对每个引导样本进行了生物等效性分析，对单个重复实验使用 80%–125% 的等效性限度。对于两个重复实验的几何平均值以及混合模型中的两个重复实验，我们执行了等效性限度为 80%-125% 的分析以及根据 CV 估计的等效性限度的额外评估。如果可以在 > 80% 的引导样本中证明统计等效性，则表明分析的功效足够。

结果

按照指南的 IVPT 测试方案 [2 ]，在 12 位捐赠者的皮肤上分别对 ORG、GEN 和 NEG（非生物等效阴性对照）三种配方进行了两次测试（图 1）。

图 1

此外，在进行本研究之前，在 Franz 扩散池中对 32 °C 的人体离体皮肤进行组织学评估，发现 6 小时后就出现了自溶现象（图2）。因此，从 6 小时后开始，扩散不再以活性物质与周围组织之间的相互作用发生，而是以越来越不受阻碍的方式流入受体隔室。因此，在 300 分钟后停止对药物扩散的评估是合理的，因为到目前为止还没有记录到药物渗透到受体介质中的情况，而是评估药物渗透到皮肤中的情况。

图 2在 32 °C 的 Franz 扩散池中对离体人类乳房皮肤进行组织学研究，时间为 0 小时、5 小时、24 小时和 48 小时

IVPT 关键研究

皮肤深度分布图显示了 MMF 在皮肤横截面上的扩散行为（图3）。在 SC 中 MMF 的比例最高，因为制剂一直放置在皮肤表面直到每个终点。在较深的皮肤层中，对于所有制剂和终点，大部分 MMF 都积聚在真皮上层（240 µm）。药理作用假定发生在约 700-900 µm 的真皮下层，小血管和汗腺位于此处。30 和 100 分钟后，25 和 40 µm 表皮中的 GEN 浓度平均比率与 ORG 相当，30 和 300 分钟后，840 和 1040 µm 最深皮肤层中的 GEN 浓度平均比率与 ORG 相当。总体而言，对于所有皮肤深度和终点，GEN 浓度大多低于测定的 ORG 浓度。尽管如此，由于 GEN 与 ORG 的 CI 超出了 80–125% 的 BE 限值，而 ORG 与 NEG 的 CI 满足了本应完全超出限值的要求，因此其效果在统计上并不显著 [ 2 ]，因此有必要采用生物统计学方法。

图 3

30、100 和 300 分钟后 MMF（糠酸莫米松）在皮肤横截面上的皮肤深度分布，显示了 ORG、GEN 和 NEG 两次重复浓度的几何平均值以及 ORG 浓度的 80–125%（= BE 限值）

生物特征分析

描述性分析

通过在散点图中显示所有皮肤切片和终点的 ORG 重复 I 与重复 II 的浓度，获得了描述性统计数据以显示重复的可比性（图4）。此处，重复 II 的浓度较高且与重复 I 的浓度不可比，因为大多数值位于 10 µm 的绝对偏差之外。这意味着在捐赠者中观察到所有测量浓度的高变异系数 (CV)（表S1）。但是，当 CV > 50% 时，计算出的等效区间不能用于等效性检验。在这种情况下，BE 接受限度扩大到最大 69.84–143.19%。

图 4

在所有三个时间点，ORG I 与 ORG II 的所有浓度 [µmol/l] 和表皮深度的散点图。虚线：绝对偏差 10 µm（任意选择的值以获得更好的方向）

生物等效性测试

为了测试 ORG 与 GEN 的生物等效性以及两者与 NEG 的非等效性，使用了几何平均值 (CI 90%)，尽管重复 I 和 II 仅在有限的范围内具有可比性。对于所有终点，所有制剂之间的等效性均计算为两次重复的几何平均值（表 S2-S4），并针对每个皮肤深度绘制图5 A）。

图 530 分钟 ( A )、100 分钟 ( B ) 和 300 分钟 ( C )后 ORG 与 GEN、ORG 与 NEG 和 GEN 与 NEG 的 90% 置信区间 (CI) 比较。如果值在绘制的等效限度（包括其置信区间）内，则在统计上等效。根据 EMA 指南草案 [ 2 ]，针对 NEG 的测试应完全超出 80–125%

在 840 µm 的表皮深度下，30 分钟后 CI 处于等效限值范围内，而在 640 和 1040 µm 的表皮深度下，它们处于扩展等效限值范围内。比较 ORG 与 NEG，在 10、25 和 640 µm 处可见不等效性，因为它们完全超出了等效限值，在 240 和 440 µm 处也是如此，因为它们完全超出了扩展等效限值。但是，对于 40、840 和 1040 µm 的表皮深度，未确定 ORG 与 NEG 之间的不等效性。对于 GEN 与 NEG 获得了可比结果，其中计算出的几何平均值和相应的 CI 均不完全超出等效限值。仅在 440 µm 的表皮深度下，才观察到不等效性（扩展水平）。总之，30 分钟后，对于所检测的任何皮肤深度，均不存在同时的生物等效性和不等效性。但是，很明显，CI 会随着皮肤深度的增加而降低。

100 分钟后，ORG 和 GEN 的 CI 在 25、240、440 和 1040 µm 的皮肤深度处均在扩展等效限度内（图5B），代表生物等效性。但是，ORG 和 GEN 与 NEG 的不等效性并未给出，因为它们完全不在等效限度或扩展等效限度之外（ORG 与 NEG 在 240、440 和 640 µm 处）。在 840 µm 处，GEN 与 NEG 甚至等效，因为它们的几何平均值在扩展等效水平内，尽管它应该完全在目前的不等效性之外。总之，100 分钟后，ORG 和 GEN 之间的整体等效性（包括扩展等效限度）高于 30 分钟后，但与 NEG 的不等效性较低。

300 分钟后（图5C），皮肤深度 440、640 和 1040 µm 处的数值在扩展等效限度内，840 µm 处的数值完全在 80–125% 限度内，代表生物等效性。仅在 240 µm 处观察到 ORG 与 NEG 的非等效性，因为数值超出了等效限度。同样，CI 在皮肤横截面上呈下降趋势。

EMA 指南草案未提及将供体和重复视为随机效应 [2 ]。将两者包括在内的混合模型分析显示，30 分钟时的 CI 较小，但较深的皮肤层除外（图 6）。因此，将混合模型分析添加到进一步的统计方法中。

图 6ORG 与 GEN 的几何平均值与混合模型的生物等效性水平（包括所有三个时间点和所有皮肤深度的 90% CI）

样本量估计

由于只有一个 ORG 与 GEN（300 分钟，840 µm 表皮深度）的等效性证明，因此这些数据用于使用 PRO POWER 在 SAS 中执行的样本量估计。计算出的几何比率为 1.04，假设的中等相关系数为 0.5（表 S5）。对于 CV 在 0.20 和 0.50 之间的这些场景，需要 10 到 43 对的样本量来根据两个独立重复提供的数据证明等效性。

模拟（引导程序）

但是，供体数量n = 10–43 并不是目标，因为也会使用生物多样性当量。进行引导模拟旨在根据单次重复、几何平均值以及混合模型中的两次重复获得的渗透数据确定足够数量的供体。为此，计算了百分比，即每个表皮深度 1000 个引导样本和每个终点不同样本量（供体数量）可以显示多少次等价，应用 80%–125% 的固定等价间隔。图 7展示了每个表皮深度和样本量从n = 4 到n = 15的终点在 30、100 和 300 分钟后的不同引导模拟结果。结果对应于可以显示等价的引导样本百分比，因此目标是实现 80% 的功效。30 分钟后，ORG_I 与 GEN_I 的比较表明，只有最多 10% 的引导样本中的某些组合可以证明等效性。这个结果并不令人惊讶，因为对 12 位供体的定期评估已经表明，平均比率的 CI 超过了 80%–125% 的等效限值。其他三项比较（重复 II、几何平均值、混合模型）取得了稍好的结果，如前所示（图 5、6、7、8），但无论如何都无法达到所需的功率（ 80 %）。这里，皮肤深度为 840 µm 的值达到了最高功率，为 73%，但需要n = 15 位供体的透视数量，这甚至超过了 EMA 指南草案提出的数量。对于 100 分钟内，对于预期供体数量为n = 15 的 ORG 与 GEN 混合模型，在表皮深度为 440 和 1040 µm 时，功率仅达到最大值 40%（图 7）。300 分钟后获得了更好的结果，其中对于 ORG 与 GEN 混合模型，对于数量为n = 14 的供体，获得了 80% 的功率，但仅限于表皮深度为 840 µm 的情况。从所有热图来看，重复 II 显示出明显比重复 I 更好的等效性。当计算几何平均值并应用混合模型时，可以观察到更好的结果。在几何平均值最强大的地方获得了最强大的结果（30 分钟后除外，图 7）。但是，由于重复 I 和重复 II 几乎无法比较（图 4），因此还应考虑重复的次数。然而，在额外的模拟中，考虑了取决于各个 CV 的估计等效区间，根据指南，这在重复设计的情况下是可能的 [ 11]。考虑延长等效间隔可得到更好的模拟结果（图 8）。例如，在表皮深度为1040µm、样本量至少为n =12的情况下，30分钟后可达到80%的功率。在表皮深度为840µm时，甚至可以分别在n =7（几何平均值）和n =8（混合模型）时实现这一目标，因此表明在这种情况下可以减少所需的供体数量。此外，在混合模型中，在表皮深度为640µm、样本量至少为n =13的情况下，可以实现>80%的功率。对于所有其他比较，均无法达到所需的80%的功率。

图 730、100 和 300 分钟后四种不同生物等效性分析的引导结果，ORG I 与 GEN I、ORG II 与 GEN II、ORG 与 GEN（几何平均值）、ORG 与 GEN（混合模型，包含捐赠者和重复的随机效应）

几何平均值和混合模型的生物等效性分析的引导法比较（百分比：从 1000 个引导样本中显示等效性的频率）每个皮肤深度和考虑的样本量为 30、100 和 300 分钟。顶行：考虑固定 CI = 80–125%。底行 (*)：将计算出的等效性限度视为 CV 的函数

类似地，进行了 100 分钟的引导模拟（图8），其中只有对于混合模型，并将计算的等效极限视为 CV 的函数，在n = 14 时，在 25 µm 的表皮深度下可获得 82% 的功率，对于n = 15 时，在 240 µm（82%）和 1040 µm（80%）下可获得 82% 的功率。对于所有其他样本大小和模型，功率均小于 80%。

300 分钟后观察到更好的结果，对于样本大小为n = 14 的混合模型，在 840 µm 的趋肤深度下，固定等效极限为 80%–125%，如前所述，达到了足够的功率。

包括计算出的几何平均值的等效限度 [见图8中的星号 (*) ]，即使样本量为n = 7 在 840 µm 时也能达到 80% 的功效，而n = 15 在 1040 µm 时能达到 81% 的功效。对于包括供体和重复的随机效应以及计算出的等效限度的混合模型，在 840 µm 表皮深度时，n = 6 的功效为 78%，n = 7 的功效为 89%。在 1040 µm 表皮深度时，样本量为n = 11 的功效达到 80%。对于所有其他组合，根据所提供的数据，均未达到所需的功效。由此，可以将样本量减少到供体数量为n = 7，尤其是对于分别从 640 µm（30 分钟）和 840 µm（300 分钟）开始的较深表皮层。

讨论

除 IVPT 外，EMA 指南草案还将其他显示生物等效性的技术视作为选择，例如体外释放试验 (IVRT)、角质层取样（胶带剥离，体内）和血管收缩试验（体内），后者仅适用于糖皮质激素，并作为混合审批程序的一部分在所选仿制药的欧洲公共评估报告 (EPAR) 中进行了描述 [9 ]。由于其他技术并不局限于特定类别的 API，因此它们也应该适用于糖皮质激素。IVPT 是我们实验室中一种定义明确的内部技术，在药物物质 MMF 分析方面也拥有丰富的经验，因此被选为计划的等效性研究的适当技术和 API。根据 EMA 草案指南 IVPT 测试方案，该方案提出“可以分别分析不同皮肤层（如角质层和表皮）中保留的活性物质的量”，我们建议包括对药物渗透行为的总体研究，并将其扩展到药物作用区域，这里是真皮，特别是当药物渗透率无法量化或太小的时候，如研究中提出的一样。

此外，EMA 草案指南 IVPT 测试方案建议避免使用全层皮肤，因为它“可能会人为延迟药物渗透” [2 ]。尽管没有进一步定义首选的皮肤类型，例如皮片皮肤，但“全层”可能与脂肪组织的厚度和皮肤状态有关。在这里，我们特意决定使用全层女性乳房皮肤，这种皮肤皮下脂肪组织很少，不会像腹部皮肤那样过度拉伸。因此，渗透速率不是受到皮肤的限制，而更多地受到水受体溶液的限制，亲脂性 API 不会渗透其中。因此，应用全层皮肤甚至对 API 渗透及其在角质层、表皮和真皮中的分布情况有益，但对其渗透无益。因此，我们能够确定观察到的皮肤切片的体积，其未定义的残端厚度 < 1040 µm。

因此，所进行的体外渗透试验表明，由于 MMF 在真皮中药理作用的位置在皮肤横截面上的 API 分布曲线，对于几个皮肤深度和终点的 MMF 浓度的几何平均值，ORG 与 GEN 具有生物等效性，而 ORG 与 NEG 和 GEN 与 NEG 具有不等效性。但是，在本分析中，只能在个别情况下证明统计等效性。在 30 和 300 分钟后，在 840 µm 的皮肤深度处发现了最佳结果。此外，NEG 样本值非常接近 ORG 和 GEN 的样本值，并且几乎从未达到与 NEG 进行比较的指南验收标准，这使人们对 NEG 的必要性产生了质疑。

IVPT 实施协议中的许多规范与其他指南（例如美国食品药品监督管理局 (FDA) 等同机构的指南）的参数有偏差 [12 ]，并且缺乏任何科学依据，例如供体和重复的数量。特别是，人体皮肤的个体间和个体内变异性对方法的标准化和可重复性的验证提出了挑战 [ 13 ]。纳入的供体越多，生物多样性的影响越大。因此，EMA 指南草案提出的至少 12 个供体数量是值得高度怀疑的。虽然该指南指出“对于体外皮肤渗透研究，如果有理由，供体的数量可以少于 12 个”，同时“每种 (…) 产品的最低实验数量不应少于 24 个”，但是当考虑两个独立的重复时，至少 12 个供体意味着什么呢？最后，似乎需要n 12，因为没有给出关于在何种条件下可以应用n 12 的陈述。此外，如此多的捐献者数量比同类指南要求的数量高出约两到三倍，例如 FDA IVPT 指南规定 4 到 6 名皮肤捐献者（取决于关键研究的足够效力）。这与所提供的数据一致，该数据发现n = 7 在 30 和 300 分钟时在较深的皮肤层中可能具有足够的效力。但是，关于执行的引导程序，n = 15 也包括在计算中，并且无法为更多时间点和皮肤深度计算等效性。尽管如此，讨论应该更多地关注重复次数而不是捐献者的数量。所呈现的 IVPT 表明，单个捐献者的重复之间的强烈个体内差异太高，无法显示所应用配方之间的（非）等效性。Meidan 和 Roper 描述了类似的结果，他们发现体外皮肤渗透研究中的个体间变异低于来自同一供体的皮肤样本的个体内变异 [ 14 ]。因此，EMA 指南草案中要进行的重复试验次数（n = 2）与 FDA 指南有很大不同，后者建议对每个供体进行四次剂量重复试验。OECD 指南“皮肤吸收注意事项”建议四个供体，每个供体进行八次重复试验 [ 15 ]。消费者安全科学委员会 (SCCS) 提出了类似的问题 [ 16[数学处理错误]≥< [数学处理错误]<]。由于EMA指南草案和对它的评论都没有为这种差异提供合理的解释，每个皮肤样本的皮肤捐献者数量和重复次数是一个有争议的问题，因为这两个参数都直接影响统计数据。12个皮肤捐献者的数量产生了同样高程度的生物多样性，这在体外实验中很难弥补，并且显著限制了数据的质量和其效力，正如本研究表明的那样。这只能通过大量独立的实验重复来弥补。在这方面，EMA指南草案缺乏关于分析方法的明确统计说明，例如FDA IVPT指南中提供的SAS代码[ 12 ]。这将引发关于置信区间和适应性CV限度的讨论。尽管EMA指南草案侧重于体外渗透试验，以A total和J max作为生物等效性参数进行比较[ 2 ]，但基于此处提供和模拟的数据，可以得出关于IVPT实验装置优化的结论，例如，包括API渗透行为进入药物作用部位，在最佳情况下，这可以导致数据统计上的改善并节省资源（皮肤、时间、材料）。增加重复次数可以产生更可靠的结果，从而可能减少所需的供体数量，因为样本量取决于CV和相关性。

然而，EMA 指南草案的当前版本仅关注在所有测试方案中比较药物的单次应用。由于几乎所有局部治疗皮肤病的情况都是在体内进行多剂量应用，因此这方面也可以纳入 EMA 指南草案的讨论中，因为这也限制了测试方案的体内-体外相关性。然而，多次应用也会增加额外的偏差，因为所用药物的量必须准确。

结论

EMA 指南草案的评论截止日期已于 2019 年到期，此后没有进一步的出版物或创新公布。这使得指南中提出的方法和要求是否适合证明生物等效性的问题变得更加有趣。所提出的研究无法揭示在每个皮肤切片中测试的两种制剂在统计上显着的等效性。引导模拟确定，根据显示的数据，减少供体数量并增加重复次数可能会更有意义。但是，对于药物在药理作用部位的量，IVPT 必须包括 API 渗透性。

以上文章为作者个人意见，不代表公众号的观点，阅读请剔除糟粕，各取所需。本公众号只是个人喜好，为公众服务的提供一个小小的窗口，任何不妥或者冒犯，可以直接联系删除。

PS：时间已经记不起岁月的不堪，春夏秋冬也唤不醒沉睡的躯壳。

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA4ODYxNjAwOQ==&mid=2653671837&idx=1&sn=fec5535d76615b4a377abdf6ee759632

临床试验时事评论

临床试验相关评论临床试验前沿信息

文献阅读丨 基于已获批的糠酸莫米松药物比较 EMA 外用产品质量和等效性指南草案的讨论

文献阅读丨基于已获批的糠酸莫米松药物比较 EMA 外用产品质量和等效性指南草案的讨论