文献阅读丨复杂外用仿制药生物等效性测试方法的进展与挑战的最新进展

文献阅读丨复杂外用仿制药生物等效性测试方法的进展与挑战的最新进展

                                  作者：我心悠扬的

内达·阿洛马里1, * ,瓦利德·阿尔胡赛尼1

 2024 年 2 月 8 日；15:1330712。DOI：10.3389/fphar.2024.1330712

摘要

大多数政府监管机构，包括美国食品药品管理局和欧洲药品管理局，都要求仿制的复杂外用产品证明其药物和生物等效性。评估复杂外用皮肤病制剂的生物等效性是一项具有挑战性的任务，需要仔细考虑几个因素。尽管比较临床研究仍被认为是确定大多数制剂生物等效性的黄金标准方法，但这些研究成本高昂，并且对检测制剂差异不敏感。因此，人们付出了巨大的努力来开发和验证替代方法，以证明生物等效性并加快提供高质量的仿制外用皮肤病产品。本文回顾了目前确定外用制剂在人体中的生物等效性的方法，特别强调了这些方法的最新进展。大多数替代方法都很灵敏且可重复，能够在短时间内减轻比较临床研究的财务负担。本文详细回顾了与每种技术相关的局限性。

关键词：生物等效性、测试方法、局部、仿制药、生物等效性豁免

1 简介

外用药物制剂主要用于将药物输送到皮肤的某些层。这些制剂包括乳膏、凝胶和软膏。由于仿制药开发和评估的复杂性，医药市场上有许多没有仿制药的外用创新品牌 (Li et al., 2018 )。在评估外用仿制药时，监管机构要求证明药物和治疗等效性，以确定新仿制药和参比药品 (RLD) 之间的生物等效性 (BE) ( Shah et al., 2015 )。BE 研究可以根据对比临床试验、药代动力学 (PK) 测量、药效学 (PD) 测量和体外研究的表现进行( Jalali and Rasaily, 2018 )。虽然对比临床试验CE-BE是建立 BE 的黄金标准，但它们通常需要许多受试者 (n > 500) 并且必须具有静态相关性，因为复杂的因素可能会影响皮肤渗透。因此，这些研究是外用仿制药研发中最昂贵的部分。监管机构可能会批准科学有效的替代方法来建立“不打算被血液吸收的药物”的 BE，这可以检测出仿制药和 RLD 之间的显著差异（食品和管理局）。

许多学者表示，比较临床试验作为证明BE的方法灵敏度较低（Yacobi 等人，2014 年；N Dri-Stempfer 等人，2009 年；Navidi 等人，2008 年）。这些局限性促使监管机构探索替代性的体外和体内方法来评估仿制外用药物的BE，并改进当前的方法。这篇综述文章的目的是总结大多数复杂外用仿制药的BE 测试方法。该综述讨论了最有前景的方法的优势和局限性，并重点关注这些方法在证明BE 方面的适用性。希望制药科学领域的先进技术将促进为这些复杂剂型开发强大的BE方法，并实现更高效、准确和简单的方法，以加速高质量仿制外用产品的上市。

2 外用药物分类系统

拟议的局部药物分类系统 (TCS) 根据复杂局部剂型组成的定性 (Q1) 和定量 (Q2) 等效性以及体外释放 (IVR) 的相似性（反映了微观结构相同性 (Q3)）将仿制药与 RLD 区分开来 ( Shah et al., 2015 )。考虑是否适合生物豁免，针对可能出现的各种情况提出了四种不同的类别。对于 TCS 类 1，RLD 和仿制药的所有三个参数 Q1、Q2 和 Q3 相同。在这种情况下，仿制药可能适合生物豁免。如果它们不相同，则不能提供生物豁免，并且需要进行额外的研究 ( Shah et al., 2016 )。在 TCS 类 2 中，仿制药具有与 RLD 相同的 Q1 和 Q2，但 Q3 不同。在这种情况下，仿制药不符合生物豁免条件，申请人必须确保产品的安全性和有效性不会按照机构要求受到影响。在 TCS 3 类中，测试产品和 RLD 之间存在 Q1 或 Q2 差异，并且可能需要进行额外的体外研究，例如赋形剂成分评估（Shah 等人，2015 年）。然而，该产品从载体中的释放和通过皮肤的递送相似，导致 Q3 与 RLD 相似。这些仿制药将有资格获得生物豁免。对于 TCS 4 类，仿制药的成分不同，导致微观结构不同（Buhse 等人，2005 年）。

简而言之，根据 TCS 分类，第 1 类和第 3 类仿制外用药物与 RLD 具有相似的特性，将有资格获得生物等效性豁免。第 2 类和第 4 类仿制药必须进行额外的体内研究以证明 BE。图 1显示了 TCS 的示意图。此外，美国食品药品监督管理局 (US FDA) 和欧洲药品管理局 (EMA) 对记录外用产品 BE 的监管要求不同。美国 FDA 为每种产品起草了具体的指南。相比之下，EMA 更喜欢“一刀切”的方法。最近的几篇出版物详细讨论了每项指南草案标准的适用性，并比较了各机构的要求（Ilić 等人，2021 年；Miranda 等人，2022 年；García-Arieta 等人，2023 年）。

图 1.

局部药物分类系统（Shah 等，2015 年）。

3 方法

3.1 临床终点对比研究

对于大多数复杂药物产品（例如乳膏、凝胶和软膏），比较临床终点研究是证明相对于 RLD 的 BE 的传统方法。这些研究通常设计为使用前瞻性仿制药产品（美国 FDA a）的随机、交叉或平行研究。虽然临床终点提供了直接的治疗结果，但也面临着一些挑战。临床终点可能受多种因素影响，包括由于环境和病理生理因素导致的高度变异性和不敏感性。此外，一些外用药物的治疗效果较弱且剂量不标准，可能会使测试具有挑战性（Carroll 等人，2004 年；Krejci-Manwaring 等人，2007 年）。这些因素会影响特定外用产品的性能，并降低此类研究的效率和可靠性。通常，比较临床试验执行起来很繁琐、成本高、需要大量的患者，并且可能无法有效检测配方变异性。出于这些原因，临床科学家建议开发更可靠、更灵敏的标准方法，用于评估外用制剂的 BE（Chen 等，2011；Harris，2015）。

3.2 药效学研究（血管收缩试验）

体内药效动力学研究也称为血管收缩试验 (VCA)，仅限于外用皮质类固醇 (也称为糖皮质激素) 产品 ( Chang 等人，2013a )。外用皮质类固醇时，血管收缩会导致可见的皮肤变白反应 ( Wiedersberg 等人，2008 )。变白方法通常称为 Stoughton-McKenzie 试验，它采用对变白的视觉评估，通过专业观察员评估的 0-4 强度等级或通过热成像、反射光谱或激光多普勒测速等定量方法 ( Aiache 等人，1980 年；Ryatt 等人，1982 年；Andersen 等人，1993 年)来评估外用制剂在健康志愿者中的 BE 。指南中讨论了视觉白化或色度计评估模型的选择（Singh 等，1999）。药效学作用与外用皮质类固醇产品的临床疗效相关。因此，FDA 目前接受 VCA 作为评估糖皮质激素外用剂型 BE 的替代方法（Chang 等，2013a；Chang 等，2013b）。

尽管该方法需要微调，药效动力学方法对半固体制剂效果很好。VCA 价格低廉，并且需要的健康志愿者比临床终点研究少。尽管 VCA 被各种监管机构所接受，但从实际角度来看，有几个限制会影响皮肤变白的强度，主要是药物载体、浓度、位置、姿势和闭塞。载体基于其特性（例如高溶解度和快速递送）会增强药物反应。因此，载体可能会影响皮肤变白的强度。外用制剂的吸收水平取决于浓度和应用时间，这可能会影响皮肤变白的强度和位置。最差的变白通常发生在手腕和肘部 1-4 厘米范围内。此外，封闭性成分往往表现出更好的药物渗透性和更大的变白强度（Schwarb 等人，1999 年；Fesq 等人，2003 年；Görne 等人，2007 年）。尽管评估结果具有很大的可变性，但该方法已成功标准化，并被 FDA 推荐在申请含糖皮质激素的外用产品的生物豁免时使用。

3.3 药代动力学研究

在特殊情况下，可以进行药代动力学分析，以评估局部用药制剂的 BE，其中药物显示出显著的血浆/组织水平，类似于口服剂型的 BE 评估。药代动力学应用的一个罕见例子包括 FDA 为利多卡因贴剂发布的指南草案，随后批准药物（ANDA；Nalamachu 和 Gudin，2020 年）。药代动力学研究主要用于确定局部用药的安全性，其中血浆中的药物水平显著且与作用部位的浓度一致。然而，这种技术在 BE 评估中的应用非常有限。

3.4 胶带剥离（皮肤药代动力学）

胶带剥离法 (TS) 也称为皮肤药代动力学 (DPK)，是一种使用胶带评估角质层 (SC) 局部生物利用度或 BE 的非侵入性方法。该技术可在体内和体外使用皮肤模型，包括人类或猪、大鼠和小鼠等动物。局部应用和渗透制剂后，TS 的基本过程是将胶带贴在皮肤上的多个部位，然后使用滚筒或压力装置施加压力。然后取下胶带并放入小瓶中以避免折叠。然后，分别量化每条胶带上的产品浓度。渗透情况可作为皮肤层内深度的指标报告。获得的数据可用于评估不同的外用制剂以确定 BE ( Escobar-Chavez 等人，2008 年)。TS 方法背后的原理是，针对 SC 层的产品必须穿透并到达更深的皮肤层，而连续去除 SC 层使该技术能够评估皮肤不同层中的外用产品（Russell 和 Guy，2009 年）。DPK 方法正在接受 FDA 的审查，并于 1998 年发布了一份指南草案，以确定外用制剂的 BE。然而，由于独立实验室对两种仿制维甲酸产品得出的结果相互矛盾，该指南于 2002 年初被撤回（Mohan 和 Wairkar，2021 年）。

TS 是一种简单、可靠且微创的方法。由于其简单性，TS 可用于各种研究领域，例如多重免疫测定和生物标志物识别。然而，一些限制可能会影响评估的质量。首先，DPK 方法仅适用于作用位点为 SC 的药物。其次，当前指南缺乏关于应收集和分析的 SC 数量或深度的明确说明。第三，也许是最复杂的限制，该指南需要一个涉及许多参与者和重复应用位点的复杂验证过程。此外，还有一些技术因素最终可能会改变评估结果。这些因素（包括皮肤表面污染）必须通过在实验前限制使用外用产品来解决。不幸的是，TS 程序中的不一致可能会导致吸收到 SC 的产品量不均匀。

3.5 皮肤微透析

皮肤微透析 (DMD) 是一种体内采样技术，可以分析皮肤药代动力学和真皮组织中的药物浓度。DMD 采样也称为真皮、皮内或皮肤微透析。当将外用制剂涂抹到皮肤上时，真皮间质液 (ISF) 中未结合的产物会由于浓度梯度而扩散到膜腔中。可以使用包含小型灌注膜系统的细探针测量皮肤细胞外空间的药物浓度，该探针充满与皮肤兼容的无菌缓冲液，可收集真皮层内的样本（Anderson 等人，1991 年；Benson 和 Watkinson，2012 年）。该技术的一个关键优势是它能够测量渗透健康和患病皮肤的外用产品（Gao 等人，2014 年）。该方法非常便宜，因为探针易于制造。然而，DMD 具有一定的内在局限性：其相对侵入性技术可能会引起炎症（Kreilgaard 等人，2001）。还需要使用相关的、合适的内部标准来确定药物浓度（Ao 和 Stenken，2006 ）。Senemar等人最近的一项研究（ 2019 ）通过比较曲线下面积 (AUC) 证实了使用 DMD 确定含甲硝唑外用产品 BE 的可行性。DMD 足以以大于 90% 的功效区分不同制剂之间的生物利用度差异，提供了科学证据表明 DMD 可用作比较临床终点试验的有前途的替代方案。

3.6 皮肤开放流微灌注

真皮开放流微灌注 (dOFM) 是一种采样技术，可通过从真皮中连续采样 ISF 来评估真皮 PK 和 PD 参数。dOFM 相对于 DMD 的主要优势在于直径为 0.55 毫米的探头设计，这是一种由聚醚醚酮 (PEEK) 制成的开放式网状物，可直接采样高分子量化合物并直接进入组织环境 ( Schaupp 等人，1999 年)。dOFM 的主要优势在于它能够评估任何外用药物，无论其分子大小、亲脂性或用于递送的配方如何 ( Bodenlenz 等人，2016 年；Kolbinger 等人，2017 年；Birngruber 等人，2022 年)。dOFM 研究表明受试者内部变异性较低，并且没有任何方法因素导致这种变异性（Bodenlenz 等人，2020 年）。此外，由于 dOFM 设置高度标准化，因此可以使用可穿戴泵在较长采样间隔内以比比较临床终点研究（数百至数千名参与者）更少的健康参与者（20-30 名）确定 BE（Zhu 和 Sun，2019 年；Birngruber 等人，2022 年）。

3.7体外释放试验

体外释放试验 (IVRT) 是一种有价值的工具，可以比较测试和 RLD 的体外释放速率。IVRT 分析药物从载体释放到受体介质中之后的情况，受体介质由合成膜隔开（ Rath 和 Kanfer，2020 年）。许多扩散系统已用于 IVRT，例如流散射、浸没池、Franz、垂直、水平、静态和左右扩散池系统（KHATANA 等人，2022 年）。使用人体皮肤的 Franz 池或垂直扩散池 (VDC) 系统在制药行业和皮肤病学领域的药物研究人员中是众所周知的。IVRT 是一种成熟且灵敏的方法，可以反映外用产品的物理化学性质的变化，例如药物溶解度、流变性质和粒度。与体内测试相比，IVRT 是一种更容易的 BE 评估方法。由于操作可以自动化，并且只需要少量产品，因此不一定需要连续采样（Supe 和 Takudage，2021 年）。与手动扩散法相比，IVRT 具有优势，因为它可以提供快速、可重复和准确的采样。Tiffner等人（2018 年）最近的一项研究强调了测试系统的基本组成部分，重点关注 IVRT 参数和特定的验收标准。

3.8体外渗透试验

体外渗透试验(IVPT) 也称为体外皮肤渗透试验，它是一种经济有效的外用药物 BE 评估方法。通常，离体人体皮肤与细胞扩散技术结合使用，后者被认为是评估皮肤药代动力学的最佳技术 ( Yacobi 等人，2014 )。IVPT 被 FDA 和 EMA 认可为确定局部作用外用药物 BE 的监管方法。大量研究表明，正确实施的 IVPT 方法可以产生与两种半固体药物 BE 的体内临床终点研究相同的结果。Lehman和 Franz (2014)的结论是，使用冷冻保存的人体皮肤进行 IVPT 比同等的药效学研究更准确、变异更小，并强烈支持将 IVPT 应用于确定复杂外用产品的 BE。此外，根据 FDA 指南，发布了针对仿制 5% 阿昔洛韦乳膏的新型实验设计，以减少建立 BE 所需的样本数量（Lim 等人，2023 年）。最近接受的使用 IVPT 技术评估外用产品 BE 的策略仅适用于快速渗透人体皮肤的药物，从而可以评估药物渗透情况。

3.9 共焦拉曼光谱

共聚焦拉曼光谱 (CRS) 是一种广泛用于人体皮肤研究的非侵入性方法。CRS 可以实时监测外用产品通过皮肤的渗透情况（Caspers 等人，1998 年；Chrit 等人，2007 年）。CRS 通过指向皮肤层的激光束量化物质吸收及其清除的速率和程度（Kezic，2008 年）。记录特定分子的独特拉曼光谱。CRS 提供了一种无损、准确且可重复的方法来获得外用产品的生物利用度。然而，CRS 的一个主要挑战是缺乏绝对量化能力（Herkenne 等人，2008 年）。最近，一些概念验证研究应用 CRS 来测量外用产品浓度。Iliopoulos等人（2023 年）探讨了使用 CRS 方法评估外用产品 BE 的可行性。研究了两种市售布洛芬凝胶制剂的体内渗透情况。Mohammed等人（2014 年）研究了七种不同的烟酰胺载体在人体皮肤模型中的体外渗透情况以及体内吸收情况。结果表明，烟酰胺信号与体外烟酰胺渗透结果成正比。这些研究表明 CRS 可以验证皮肤药物的 BE。

3.10 近红外光谱

近红外光谱 (NIRS) 已被广泛用作评估产品渗透皮肤层的无创方法。NIRS 背后的原理如下：近红外 (NIR) 波可以穿透皮肤，通过测量相应的红外吸收来量化产品扩散，然后进行线性多元统计计算（Mak 等人，1990 年）。NIRS 是一种先进、快速、无创的技术，可提供体内实时监测信号。NIRS 优于其他方法，因为它能够分析挥发性药物。出于这些原因，FDA 在 2021 年提供了有关 NIRS 开发、验证和使用的指导文件。Medendorp等人（2006 年）使用 NIRS 监测了无毛豚鼠皮肤中几种产品的体内浓度。SAKIRA等人（2021 年）使用 NIRS 结合多元数据分析开发了甲硝唑分类和定量的化学计量模型。综合起来，NIRS 和 CRS 因其无损特性而成为颇具前景的技术。它们在复杂局部 BE 评估中的未来应用需要优化。

3.11 体内外相关性

FDA 将体外-体内相关性 (IVIVC) 定义为“描述剂型的体外特性与相关体内反应之间关系的预测数学模型” ( Lu 等，2011 )。IVIVC 的建立在药品开发和 BE 领域前景广阔，旨在利用体外药物释放性能预测体内药物行为。建立局部应用药物的 IVIVC 必须考虑各种药物参数，如生理、物理化学和生物制药特性，以及体外参数，如 IVRT 或 IVPT 和体内参数，如从 TS 或 VCA 获得的数据 ( Shah，2005 )。到目前为止，还没有起草针对局部复合制剂的监管 IVIVC 指南。然而，FDA 文件中描述的 ER 口服剂型的原则已被用于建立局部产品的 IVIVC。通常，建立 IVIVC 模型涉及数学建模和数据分析， Lu 等人对此进行了详细回顾。 （2011 年）。成功开发的 IVIVC 模型可用作 BE 研究的替代方法，以获得生物豁免。IVIVC 还可用作外用制剂产品开发过程中的指南，以确保最终产品的安全性和有效性。尽管由于 BE 过程的复杂性，为复杂的外用产品建立有意义的 IVIVC 颇具挑战性，但最近的一项研究已显示出令人欣喜的结果。Rath和 Kanfer（2023 年）进行的一项研究分别在健康人类参与者中建立了 IVRT 和 TS 后外用甲硝唑乳膏的 IVIVC，并且参考产品和测试产品具有良好的定性和定量相关性。

3.12 基于生理的药代动力学建模

基于生理的药代动力学 (PBPK) 建模和模拟是一种定量方法，可以预测活性成分在人体内的药代动力学特征。该方法以机械的方式考虑了许多内在（例如年龄、遗传和器官功能障碍）和外在（例如药物间相互作用）因素。更具体地说，皮肤 PBPK 模型描述作用部位或附近的皮肤渗透，并通过在监管层面对健康个体和特殊人群（例如儿科和孕妇人群）中的患者进行虚拟筛选来支持替代 BE 方法（Hamadeh 等人，2021 年；Yun 等人，2022 年）。PBPK 模型在局部制剂方面的特殊优势在于它们能够包括受试者间和受试者内的皮肤生理参数（例如皮肤厚度、血流量和皮肤 pH 值）的差异。

PBPK 模型利用计算机模拟系统，与同类 BE 研究相比，可减少时间和相关成本，并已广泛应用于仿制药开发、安全空间构建和审批流程。已开展虚拟 BE 研究，以加快仿制药逐案申请生物豁免的速度（Tsakalozou 等人，2021 年）。FDA 已经认识到 PBPK 建模和模拟作为替代 BE 方法的作用，并于 2014 年授予了外用皮肤病药物领域的第一笔资助，随后又获得了几笔资助（Lionberger，2019 年；Zhao 等人，2019 年）。2019 年 5 月 16 日，FDA 批准了第一份简化新药申请 (ANDA)，用于仿制药 1% 双氯芬酸钠外用凝胶，其中申请人采用了 PBPK 模型来展示 BE（Tsakalozou 等人，2021 年）。需要协作的科学努力来进一步增强这些针对复杂局部皮肤病产品的 PBPK 建模和模拟方法。

4 未来机遇

在这篇科学综述中，我们介绍了几种有前景的局部皮肤病产品替代 BE 方法的进展及其局限性，这些方法总结在表 1中。比较临床终点研究的成本很高，因此有必要开发有效的方法来促进复杂局部产品的开发、注册和批准。局部产品 BE 评估的未来方向将是改进和标准化现有方法以用于监管目的。此外，由于这些方法的局限性并不相同，因此综合使用多种方法可能足以证明 BE。结合体外研究，使用 PBPK 模型可能对局部皮肤病产品的详细表征研究有充分的好处。

表 1.

复杂外用仿制药生物等效性测试方法的进展与局限性总结。