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通过CRISPR-Cas12a系统，怎样实现无预扩增步骤的SNP超灵敏检测呢？今天的文章有什么新点子呢？大家随小编一起来看看今天的文章吧~
在疾病筛查、食品安全、环境监测等众多场景中，靶标预扩增步骤结合荧光定量PCR已成为DNA检测的有力工具。但基于靶标扩增的DNA检测通常存在交付周期较长等缺点，该周期一般涉及样本运送以及复杂、耗时的DNA提取和扩增等过程，且检测结果的可靠性受多种因素影响，如模板质量、引物效率、杂质影响、操作程序等，因此，无扩增核酸检测平台的开发已成为核酸检测领域的研究重点及热点。
华中农业大学Weng等在“CRISPR-Cas12a Biosensor Array for Ultrasensitive Detection of Unamplified DNA with Single-Nucleotide Polymorphic Discrimination”一文中报道了一种基于CRISPR-Cas12a的新型生物传感器CRISPR Cas12a-gFET，可用于ssDNA和dsDNA靶标的无扩增、超灵敏检测。CRISPR Cas12a-gFET对人乳头瘤病毒HPV-16的最低检测限为1 aM，对大肠杆菌细菌DNA靶标最低检测限为10 aM。CRISPR Cas12a-gFET还可以成功地对SNP进行区分。CRISPR Cas12a-gFET传感器为无扩增、超灵敏、可靠及高度特异性的DNA检测提供了一种优异的解决方案。
CRISPR-Cas12a介导的无预扩增、超灵敏的DNA检测系统CRISPR Cas12a-gFET，主要利用Cas12a信号放大和石墨烯场效应晶体管（gFET）高性能传感能力的协同作用，使锚定在石墨烯表面的探针裂解，并能超灵敏地读取信号，以实现CRISPR Cas12a-gFET的aM级灵敏度检测（图1）。石墨烯的高载流子迁移率使gFET能够灵敏地探测表面发生的生物识别事件，表面的局部生物识别事件会改变电荷载流子密度，并被转化为转移特性的改变。gFET表现出V形传输特性，其中局部最小值称为电荷中性点（CNP）。CNP栅极电压的偏移用于确定转移特性的偏移，从而量化生物识别事件。在靶DNA存在的情况下，锚定在石墨烯表面的带负电荷的ssDNA探针被Cas12a裂解，导致电子载流子密度的增加，从而导致转移特性和CNP电压左移。此外，研究人员在单个传感器芯片上采用48通道阵列设计，通过减少设备间差异导致的测量异常值的影响来增强可靠性。与大多数生物传感器平台相比，该48通道设备提供了足够的统计样本量，以实现高水平的测量置信度。这也表明此设计可大规模制造，应用于社区等基层检测。
为了证明CRISPR Cas12a-gFET平台用于超灵敏DNA检测的可行性，研究者使用了报道的Cas12a-crRNA-靶标-探针组合，在电化学传感器上进行无扩增的HPV-16检测。由于与crRNA互补的靶标ssDNA足以激活Cas12a的反式切割活性，因此研究人员有意采用单链HPV-16靶序列来验证CRISPR Cas12a-gFET生物传感器检测ssDNA的多功能性。转移特性的代表性测量显示，在加入含有1 fM合成靶标ssDNA HPV-16后经CRISPR-Cas12a反应，CNP电压发生左移，这与探针切割后电子载流子密度的增加相对应。对合成的ssDNA HPV-16靶标，CRISPR Cas12a-gFET生物传感器最低检测限为1 aM（图2），在1 aM至100 pM的动态范围内，传感器响应与HPV-16合成靶标的对数浓度之间存在线性关系（图3），这也表明了无需靶标预扩增即可进行超灵敏DNA检测的可行性。
基于上述ssDNA靶标的超灵敏检测，研究人员进一步将CRISPR Cas12a-gFET应用于dsDNA靶标检测。研究人员选择非致病性大肠杆菌作为致病性大肠杆菌O157：H7的替代物，基于其16S rRNA基因，设计了12条crRNA。其中，crRNA7被筛选用于后续实验。此外，为了确保crRNA7的高特异性，研究者将一系列单碱基错配引入靶位点。当错配在靶核酸近PAM序列（TTTV）1-7位点时，crRNA7几乎没有活性。而它对大多数其他核苷酸位置的突变则具有耐受性，并且具有高达 50% 的完美匹配活性。这种错配耐受性水平显示了使用crRNA7基于LbCas12a检测大肠杆菌的高特异性（图4）。
首先，基于先前LbCas12a对富含胞嘧啶（C）的探针显示出最高的反式切割效率的研究报道，研究人员比较了20-nt polyC和polyA序列的反式切割性能，见过显示两种探针表现出相似的反式切割活性（polyC 10.15% vs. polyA 11.53%，图5），这可能由于反式切割反应在孵育30分钟后饱和所致，实验最终选用20-nt polyC探针。随后研究人员将大肠杆菌靶标质粒梯度稀释后进行测定，确定最低检测限为10 aM。
为了探究CRISPR Cas12a-gFET平台的SNP区分能力，研究人员针对完美匹配靶标和四个单碱基错配靶标进行了测试。选择了已荧光检测验证的最高的脱靶靶标MM19以及不同位置错配（MM3、MM9和MM15）的三个单碱基错配靶标进行实验。各使用1 pM单碱基错配靶标测量了CRISPR Cas12a-gFET的信号响应，结果表明，各靶标尽管引起CNP电压的变化，但所有错配的crRNA-靶标对产生的偏移明显低于完美匹配靶标的信号响应（图5），这表明CRISPR Cas12a-gFET在区分SNPs方面具有高度特异性。
图5. Cas12a-gFET检测非致病性大肠杆菌质粒dsDNA
作者构建了一种基于CRISPR-Cas12a的新型生物传感器CRISPR Cas12a-gFET，可用于ssDNA和dsDNA靶标的无扩增、超灵敏检测，具有aM级灵敏度和SNP区分能力。因此当样本中仅存在微量靶DNA时，CRISPR Cas12a-gFET仍可以满足严格的临床检测需求。针对其他疾病检测、环境检测等应用，只需要改变检测中的crRNA序列。因此，CRISPR Cas12a-gFET是一种极具潜力的通用型、适合大规模生产和广泛应用的DNA检测平台。
参考文献：
[1] Weng Z, You Z, Li H, et al. CRISPR-Cas12a Biosensor Array for Ultrasensitive Detection of Unamplified DNA with Single-Nucleotide Polymorphic Discrimination[J]. ACS sensors, 2023, 8(4): 1489-1499.
