TOLO智库 | CRISPR介导适配体传感器如何助力阿尔茨海默病诊断？

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，也是痴呆的最常见原因，其特征是β淀粉样蛋白（Aβ）肽在大脑中的积累。随着人口老龄化进程加剧，阿尔茨海默病患病率日趋增加，且该病尚无特效治疗方案。因此，为提高老年人晚年生活质量，可对阿尔茨海默病进行早期筛查，尽早干预治疗，延缓发病。

文章“CRISPR-Powered Aptasensor for Diagnostics of Alzheimer’s Disease”提出了一种基于适配体和CRISPR技术的阿尔茨海默病生物标志物检测平台，该平台可以对脑脊液 （CSF） 样本中β淀粉样蛋白（Aβ40 和 Aβ42）进行简单、快速、经济的定量检测，实现临床中AD患者的早期筛查。研究者将Aβ生物标志物适配体的高特异性与基于CRISPR-Cas12a的荧光检测相结合，构建了CRISPR介导的适配体传感器，该传感器能在 60 分钟内检测CSF样品中的Aβ40和Aβ42，检测灵敏度分别为1 pg/mL和0.1 pg/mL，并能实现定量检测。此外，研究者还通过Aβ42 水平及c（Aβ42）/c（Aβ40）比值对AD患者和健康对照组（CN）进行了准确的诊断分类，结果优于传统 ELISA法检测。该CRISPR介导的适配体传感器在临床AD的早期筛查与诊断中显示出极大的应用潜力。

研究者通过CRISPR介导适配体传感器技术对脑脊液中的Aβ生物标志物进行定量检测，从而判定阿尔茨海默病患者。首先将带有链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的适配体-激活剂进行孵育，形成MB-APT-Act复合物，并将所得复合物MB-APT-Act分离（图1A）；然后将CSF样本加入MB-APT-Act溶液中室温孵育，当Aβ存在时将导致APT-Act结构的构象变化，使得MB-APT-Act复合物释放出激活剂（图1B）。随后将磁珠与上清液分离，并将分离后含有激活剂的上清液加入CRISPR反应体系中，溶液中的激活剂会激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，从而产生荧光信号（图1C）。结果显示，Aβ生物标志物诱导释放的激活剂浓度越高，荧光信号越强，从而实现对CSF样本中Aβ生物标志物含量进行定量检测（图1D）。最终，研究者通过Aβ42 水平及c（Aβ42）/c（Aβ40）比值对AD患者和CN进行了分类判定（图1E）。

图1. CRISPR介导适配体传感器检测Aβ生物标志物原理

为提高CRISPR介导适配体传感器的灵敏度和准确性，研究者对样本的孵育温度，反应条件和磁珠上适配体激活剂浓度进行了优化。结果显示，MB-APT40-Act40与Aβ42间不存在非特异性相互作用，而Aβ40 (10 ng/mL和10 pg/mL)有强烈荧光信号，温度25°C增加到45°C过程中，荧光信号会随温度升高而减弱，故，Aβ40检测最佳孵育温度为25°C，孵育时间为5 min（图2A，2B）。随后，作者研究了APT40-Act40在磁珠上的浓度对检测体系的影响，结果显示，Aβ40在MB-APT40-Act40浓度为12.5 μM时最佳（图2C）, Aβ42在5 μM时浓度最佳（图2D）。

图2. CRISPR介导适配体传感器的检测条件优化

研究者通过检测CSF中梯度稀释的Aβ生物标志物来评估CRISPR介导适配体传感器的定量检测性能。首先，通过实时荧光和终点荧光两种方法检测Aβ40靶标，结果显示荧光信号随靶标Aβ40浓度的升高而增强（图3A，3B），且CRISPR反应速率与目标浓度成正相关性。研究者最终选定终点荧光法（图3C）和斜率法（图3D）来定量检测Aβ40靶标，这两种方法的检测灵敏度可达到1 pg/mL，优于ELISA法的6 pg/mL。对于Aβ40的定量检测，用终点荧光法和斜率法在10 到 250 pg/mL 和 10 到 1000 pg/mL范围内均获得了良好的线性范围（图3E，3F）。基于上述对比，斜率法在时间、线性、背景信号上展示了更好的优越性。同样，研究者对Aβ42靶标进行了定量检测，终点荧光法和斜率法检测灵敏度为0.1 pg/mL，优于ELISA的1 pg/mL（图3G，3J），且在1到1,000 pg/mL范围内显示出良好的线性相关（图3K，3L）。上述实验结果表明，CRISPR介导适配体传感器对靶标Aβ40和Aβ42的定量检测表现出优于ELISA的灵敏度和准确性。

图3. CRISPR介导适配体传感器的定量检测性能

为了进一步验证核酸适配体传感器的临床效用，研究者用临床CSF样本进行检测，并将其性能与常规ELISA检测法进行了比较（图4A），CRISPR介导适配体传感器检测时间为60 min，比ELISA快4倍。此外，CRISPR介导适配体传感器预估Aβ40检测成本为4.11美元，Aβ42检测成本为4.21美元（图4B，4C），约为ELISA法的一半。随后，研究者检测了19份临床样本，分别用终点荧光法和斜率法定量检测Aβ40和Aβ42，并重复实验，结果与ELISA法进行对比（图4D-4K），结果显示，CRISPR适配体传感器检测方法与常规的ELISA法一样，均表现出良好的相关性。

图4. CRISPR介导适配体传感器检测临床脑脊液中Aβ的对比验证

研究者通过ELISA和CRISPR介导适配体传感器两种方法，表述了AD患者和CN中CSF Aβ40和Aβ42水平的分布（图5）。研究发现，AD组和CN组在Aβ40水平上无显著差异（图5A-5C），而Aβ42在临床CSF样本中，AD患者明显低于CN组（图5D-5F）。根据前期研究，c（Aβ42）/c（Aβ40）的临界值为0.07，c（Aβ42）的临界值为637 pg/mL。因此，先将样本分为四个区域类别，再将ELISA和CRISPR介导适配体传感器两种方法的检测结果进行对比。结果显示，ELISA法AD样本检出率为50%，CN检出率为90.9%；CRISPR介导适配体传感器法AD样本检出率为62.5%，CN为90.9%（图5H，5I）。CRISPR介导适配体传感器检测法优于传统的ELISA检测法。

图5. AD患者和CN脑脊液Aβ40、Aβ42水平的统计分析及诊断分类

研究者构建了一种新型的CRISPR介导适配体传感器，可以快速、高效地定量检测阿尔兹海默症Aβ40和Aβ42生物标志物。该检测方法可在60 min内对脑脊液样本中Aβ40和Aβ42进行定量检测，其灵敏度分别为0.1 pg/mL和1 pg/mL。并定量检测了临床脑脊液样本中的Aβ40和Aβ42水平，并通过Aβ42 水平及c（Aβ42）/c（Aβ40）比值对AD患者和CN进行了分类判定。该CRISPR介导适配体传感器有望实现AD生物标志物的快速、高通量检测，使AD患者的早期诊断和准确分类成为可能。

参考文献：

[1] Jia Z, Maghaydah Y, Zdanys K, et al. CRISPR-Powered Aptasensor for Diagnostics of Alzheimer’s Disease[J]. ACS Sensors, 2024,9(1):398-405.