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病从口入。食品安全问题备受关注。食源性病毒是引发食源性疾病的主要原因之一，但其传统检测方法耗时、费力。如何把CRISPR的特异性优势与拉曼光谱的超灵敏优势相结合，应用于食源性病毒检测呢？大家随小编一起来看看今天的文章吧~
食品安全问题备受关注。食源性病毒是引发食源性疾病的主要原因之一，建立对食源性病毒的快速、准确、特异性的检测方法至关重要。表面增强拉曼光谱（SERS）因其优越的灵敏度和特征指纹光谱等优势，具有巨大的应用潜力。但由于SERS的局限性，需在特定条件下才能实现特异性检测。为了提高基于SERS的核酸检测的特异性和准确性，近日，上海师范大学赵渝课题组开发了CRISPR-Cas12a介导的SERS技术，并成功应用于食源甲型肝炎病毒（HAV）的检测，最低检测限（LOD）为 8.23 fM，该法利用CRISPR-Cas12a的靶向识别能力和超灵敏的SERS标签，克服了SERS检测特异性不足的缺陷，同时解决了由镁离子引起的胶体金/银纳米聚集问题。该研究论文“A CRISPR/Cas12a-powered gold/nickel foam surface-enhanced Raman spectroscopy biosensor for nucleic acid specific detection in food”发表在 Royal Society of Chemistry期刊上。
CRISPR-SERS传感器利用CRISPR-Cas12a特异性识别靶标HAV-cDNA，并将ssDNA-ROX报告探针整合到金/镍泡沫基板（Au-NFs）表面。通过检测Au-NF表面信号分子ROX的SERS强度变化来确定靶标DNA是否存在。首先，Cas12a-crRNA通过序列互补配对，特异性识别靶HAV-Cdna，Cas12a顺式切割靶标DNA，并激活其对非靶标ssDNA的反式切割活性，随机剪切周围的ssDNA，与Au-NF连接的ssDNA-ROX报告探针被剪切。经洗涤，信号分子ROX从体系中分离，特征ROX的λ强度降低。当靶标DNA不存在时， Cas12a – crRNA的反式切割活性不能被激活，与Au-NF连接的ssDNA-ROX停留在原来的位置。此时，信号分子ROX的拉曼峰强度几乎保持不变。该传感器使用“signal off”策略。
图1 CRISPR-SER核酸检测原理
表面增强拉曼光谱的基板是引发SERS效应的关键。作者首先利用扫描电镜（SEM）对Au-NFs进行了表征。Au-NFs是一种蜂窝状的三维网格结构的柔性材料，孔径和密度小，具有一定的粗糙度和较大的比表面积。以镍泡沫为基板，通过氯金酸与金属镍的取代反应，在镍泡沫上生长出金纳米锥。如图2B-C，金纳米锥在镍泡沫表面分布均匀。在镍泡沫上直接生长出的金/银纳米结构可以在三维聚焦体积中包含更多的“热点”分子，从而增加SERS信号的强度。由于纳米结构周围的电磁场分布不均匀，在空间狭窄的区域高度分布，如尖端处。空间间隙在产生大幅度的电磁场增强的同时，在尖端出现“避雷针效应”，因此金在镍泡沫上生长形成的纳米锥状结构，可以导致更大的电磁场增强，提高SERS效应。
作者对CRISPR-SERS生物传感器检测HAV-cDNA的可行性进行了分析，结果表明（图3A），当且仅当Cas12a、crRNA和靶DNA存在时，拉曼强度降低；同时使用荧光报告探针（FQ-ssDNA, 200 nM）对靶DNA进行荧光验证（图3B），结果显示，当且仅当Cas12a、crRNA和靶DNA存在时，产生荧光信号。
作者首先对氯金酸与镍泡沫的反应时间进行了优化，当还原时间为10min时SERS信号最强（图4 A）。作者随后对ssDNA-ROX报告探针浓度进行了优化优化。ssDNA-ROX探针粘附在基板上的量对CRISPR-SERS生物传感器探针的灵敏度和稳定性影响很大。经测定，测试探针浓度在10-2000 nM范围内，拉曼强度逐渐增加，兼顾经济因素，在后续研究中均使用1000 nM ssDNA-ROX探针（图4B）。作者还对ssDNA-ROX与镍/金泡沫的反应时间进行了优化。ROX-ssDNA的巯基与Au-NFs的金形成Au-S键，经测定，反应40 min最为理想（图4C）。作者最后对CRISPR检测时间进行了优化（30min，图4D）。
在优化条件下，CRISPR-SERS能实现对HAV-cDNA的定量分析。如图5A所示，随着HAV-cDNA浓度的增加，拉曼强度逐渐降低。在2.39×10−9到4.78×10−13 mol/L检测范围内，观察到ΔI（强度变化）和HAV-cDNA浓度的对数线性相关（R2=0.9908）（图5B）。CRISPR-SERS最低检测限为8.23 fM。与其他基于SERS的核酸检测方法相比，该方法灵敏度更高，检测更方便，避免了复杂而苛刻的扩增步骤。此外，为了模拟复杂的真实检测环境，作者同时检测了混合病毒样本（mix1含HAV-cDNA；mix2不含HAV-cDNA）及阳性和阴性对照样本。结果如图5C所示，阳性组以及混合了HAV-cDNA的mix 1，其拉曼强度值都大幅增加，证实了CRISPR-SERS优异的检测特异性。
最后作者探索了CRISPR-SERS在实际食品样品中的应用潜力。作者将Cas12a-SERS生物传感器与核酸检测的“金标准”RT-PCR法进行了比较，以评估基于SERS的方法的准确性。RT-PCR实验依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4784-2017《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法 实时RT-PCR》进行。作者选择瓶装水作为检测样本，并制备不同浓度的HAV-cDNA人工污染样品。CRISPR-SERS在瓶装水检测中的回收率为82.23-107.99%，表明所建立的生物传感器适合检测该食源性病毒的核酸，且CRISPR-SERS与“金标准”RT-PCR的结果一致。
课题组结合了SERS检测与CRISPR技术的优势建立了一种高特异性的食源性病毒核酸检测方法，构建了CRISPR-SERS传感器，该系统包含金/镍泡沫基板(Au-NFs)和ssDNA-ROX报告探针。CRISPR-SERS成功应用于食源甲型肝炎病毒（HAV）的快速检测（30 min；LOD，8.23 fM）。该法还克服了CRISPR-SERS中常见的由镁离子引起的胶体金/银纳米聚集现象。CRISPR-SERS的因其快速和高特异性等优势，有望成为核酸检测的替代方法之一。
参考文献：
[1] Liu Y, Gou S, Qiu L, Xu Z, Yang H, Yang S, Zhao Y. A CRISPR/Cas12a-powered gold/nickel foam surface-enhanced Raman spectroscopy biosensor for nucleic acid specific detection in foods. Analyst. 2024 Aug 19;149(17):4343-4350. doi: 10.1039/d4an00778f. PMID: 39051914.
