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精准肿瘤细胞杀伤是解决癌症临床治疗问题的关键。基因组不稳定性和突变是癌症的重要特征。特征性基因突变已成为理想的肿瘤特异性治疗靶点，为精确肿瘤治疗提供了基因型特异性方法。那么如何利用CRISPR技术实现基因特异性地杀伤肿瘤细胞呢？带着这个问题，随小编一起来看看下面的文章吧~
为了将mtDNA中的单碱基突变转化为药物释放的开关，有必要设计一种分子识别和信号转换的创新工具。Cas12a是一种V型CRISPR系统，与工程CRISPR RNA (crRNA)具有高效的序列靶向结合和单碱基分辨率特异性。其由靶DNA发起的单链DNA (ssDNA)的非特异性切割已被广泛用于体外和体内核酸信息的识别和感知，从而实现mtDNA响应性药物释放。然而，线粒体靶向递送Cas12a/crRNA复合物并有效激活其细胞内反式切割活性是Cas12a系统控制细胞内药物释放的主要瓶颈。
利用核酸滚环扩增反应合成多功能DNA纳米载体，其序列包含具有肿瘤细胞靶向性的Sgc8核酸适体和线粒体膜靶向的细胞色素C核酸适体，通过碱基互补高效装载光敏剂和Cas12a/crRNA复合体(图1)。在Cyt C apt的介导下，MIDRS可以将Cas12a/crRNA复合物、Ce6-Q和Mg2+共同引入线粒体。在靶向线粒体后，MIDRS识别并切割肿瘤细胞特异性mtDNA，随后Cas12a反式切割活性降解核酸纳米载体，从而释放Ce6光敏活性，精准杀伤肿瘤细胞。
图2.MIDRS的制备与表征
作者系统地考察了MIDRS被细胞摄取后的亚细胞器分布（图3）。共聚焦，WB及流式实验结果均表明DNA纳米载体可将Cas12a/crRNA复合体递送至线粒体中。共聚焦实验结果表明MIDRSMT可在B16细胞中响应特征基因产生活性氧，进而使线粒体膜电位下降。活死细胞染色和CCK8实验结果均表明MIDRS可高效响应线粒体基因突变损伤肿瘤细胞（图4）。
图3.MIDRS靶向线粒体，通过识别mtDNA诱导癌细胞死亡
根据之前的线粒体膜电位的变化，作者进一步考察了其对线粒体稳态的影响。如图所示，线粒体呼吸链复合物1、2的活性均降低，线粒体通透性也有所上升。此外，Cas12a的基因编辑和ROS共同使得突变型mtDNA受损。文献调研表明，部分受损的mtDNA可从线粒体中释放，在胞质中降解或激活胞质DNA感受器。作者随后通过免疫荧光和荧光定量PCR表征了胞质中mtDNA。并通过转录组学和WB实验确认了cGAS-STING通路的激活（图5）。ELISA和流式实验结果也表明B16可释放1型干扰素激活DC细胞。这些结果表明MIDRS基因型特异性地损伤线粒体促进mtDNA释放，从而激活先天性免疫（图6）。
图5. MIDRS促进mtDNA释放到细胞质中，激活细胞质DNA传感器
图6. 在对mtDNA中的SNV产生应答后，MIDRS激活cGAS-STING通路
接下来，作者评估了MIDRS在体内靶向肿瘤细胞的能力（图7）。从b16荷瘤小鼠和双侧异种移植瘤模型的小动物活体成像，组织离体器官及肿瘤组织切片的结果中可以看出，MIDRS可特异靶向体内携带基因突变的肿瘤组织，响应突变型线粒体DNA产生荧光信号。此外，在异质性小鼠荷瘤模型中，MIDRSMT只在肿瘤组织中产生荧光信号，肿瘤组织免疫荧光切片和流式分析结果显示，MIDRS产生的荧光信号与B16肿瘤细胞高度相关。这表明MIDRS可在体内实现细胞分辨率的药物精准释放。
图7. 利用MIDRS技术在体内鉴定肿瘤特异性mtDNA突变细胞
因此，在体内，MIDRS能够识别并杀死线粒体中携带特异性mtDNA SNVs的肿瘤细胞(约82.6%)，并同时激活ICD和先天性免疫，从而产生更强的抗肿瘤免疫应答。利用MIDRS激活的全身免疫反应，有效抑制肺转移瘤的生长（图8-9）。
图9. MIDRSMT对B16转移瘤模型小鼠的抗转移作用
除了光动力疗法外，化疗是临床上广泛应用的肿瘤治疗方法。为了证明MIDRS的普遍性，作者制备了负载阿霉素（DOX）的MIDRS，命名为MIDRSDOX。结果表明，MIDRS可以识别特定基因型的DNA并自我降解释放包封的DOX。MIDRSDOX-MT诱导了68.8%的B16细胞凋亡，而对野生型细胞无明显影响。与光动力治疗不同，化疗药物不需要激光照射，这使得MIDRSDOX更适合肿瘤转移的治疗。因此，作者通过构建B16肺转移动物模型，探索了MIDRSDOX在体内的肿瘤特异性杀伤能力。如图所示，MIDRSDOX-MT治疗有效地减少了肺转移。综上所述，MIDRS可精准释放化疗药物，抑制转移型肿瘤（图10）。
参考文献：
[1].Li Y, Xu R, Wu Y, Guo J, Quan F, Pei Y, Huang D, Zhao X, Gao H, Liu J, Zhang Z, Shi J, Zhang K. Genotype-specific precision tumor therapy using mitochondrial DNA mutation-induced drug release system. Sci Adv. 2023 Sep 29;9(39):eadi1965. doi: 10.1126/sciadv.adi1965. Epub 2023 Sep 27. PMID: 37756407; PMCID: PMC10530102.
