TOLO智库 | 乳腺癌生物标志物circROBO1和BRCA1同时检测：CRISPR-Cas13a/Cas12a系统

乳腺癌（BC）是最常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因。临床诊断上通常通过乳房X光检查，磁共振成像，超声波，计算机断层扫描，正电子发射断层扫描和活检等方法进行诊断，但这些方法存在价格昂贵，耗时长等缺点。作为替代方案，在体液中发现的其他生物标志物已显示出BC早期诊断的潜力。同时检测经典生物标志物 BRCA1 和 circROBO1 可以同时从DNA和RNA检测角度对BC进行交叉验证评估，从而实现对BC准确、便捷地诊断。同时检测多个生物标志物的方法有电化学法，化学发光法，荧光法等，其中，荧光法具有操作简单、响应速度高、灵敏度高等独特优势。

本文作者在“Simultaneous detection of breast cancer biomarkers circROBO1 and BRCA1 based on a CRISPR-Cas13a/Cas12a system”一文中研究建立了基于簇规则间隔短回文重复序列CRISPR-Cas13a/Cas12a的检测系统，用于同时荧光检测乳腺癌生物标志物circROBO1和BRCA1。CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a分别被各自的靶标激活，导致短RNA和DNA报告基因的切割，从而产生FAM和ROX荧光信号。由于FAM和ROX的荧光强度分别取决于circROBO1和BRCA1的浓度，同步荧光扫描可以实现circROBO1和BRCA1的一步法检测，检出限分别为0.013 pM和0.26 pM。该系统具有高度的灵敏度和特异性，在检测临床样本方面具有很高的诊断潜力。此外，文中还探讨了circROBO1和BRCA1之间的内源性RNA的竞争机制，为乳腺癌的内在调控机制提供了可靠的依据。

基于CRISPR-Cas13a/Cas12a系统的实验结果（图1），Cas13a/crRNA1和Cas12a/crRNA2复合物（图1A）可以分别特异性识别circROBO1和BRCA1，从而触发CRISPR-Cas系统的反式切割活性（图1B）。激活后，CRISPR-Cas13a非特异性切割RNA报告基因，产生FAM荧光信号；同时，CRISPR-Cas12a切割DNA报告基因，产生ROX荧光信号。随着circROBO1和BRCA1基因浓度的增加，FAM和ROX荧光信号随之增强。因此，circROBO1和BRCA1可以用同步扫描荧光技术同时检测FAM和ROX的荧光信号。

研究者通过凝胶电泳和荧光测量来鉴定CRISPR-Cas13a/Cas12a系统的反式切割活性（图2）。单链RNA（ssRNA，21 nt）（图2A）和单链DNA（ssDNA，21 nt）（图2C）分别为CRISPR-Cas13a/Cas12a系统的切割底物。在图2B和D中，RNA报告基因和DNA报告基因分别用于评估CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a的裂解能力。当用circROBO1激活Cas13a/crRNA1复合物时，ssRNA 的条带消失（泳道 e），表明发生了反式剪切。由于浓度较低，circROBO1和BRCA1在图2A和图C中没有产生任何迁移带。这种裂解过程也可以从520纳米波长处FAM的显著荧光峰得到证明（图2B）。同样，在图2B中，CRISPR-Cas12a也能裂解ssDNA。同样，CRISPR-Cas12a也能在图2C中剪切ssDNA（图2D）。

研究者通过实验证明了CRISPR-Cas13a/Cas12a系统的交叉反应性。在图3A中，随机序列为21 nt的ssDNA（通道a）或ssRNA（通道d）呈单条带。与活化的CRISPR-Cas12a混合后，ssDNA条带消失（通道c），ssRNA条带保持完整（通道f），表明CRISPR-Cas12a只切割ssDNA，不影响ssRNA。同样，在CRISPR-Cas13a中，观察到的ssDNA条带（通道b）和减少的ssRNA条带（通道e）表明，CRISPR-Cas13a可以切割ssRNA。为了进一步验证该体系的交叉反应性，同步扫描荧光光谱（图3B），circROBO1和BRCA1的信号溶液在FAM和ROX对应波长处有荧光信号（曲线a），表明激活的CRISPR-Cas13a/Cas12a系统可以切割RNA和DNA报告基因。而在仅BRCA1存在的情况下，ROX荧光信号被保留，FAM荧光信号消失（曲线b），这表明只激活了CRISPR-Cas12a切割DNA报告基因。同样，circROBO1的存在只激活了CRISPR-Cas13a 切割RNA报告基因（曲线c）。circROBO1和BRCA1的缺失导致了基因编辑失败激活CRISPR-Cas13a/Cas12a系统，因此RNA报告基因和DNA报告基因都不能被切割，几乎无荧光信号（曲线d）。CRISPR-Cas13a/Cas12a系统是同时检测circROBO1和BRCA1的可行方法，没有交叉干扰，从而确保了该检测的极好特异性。

随后，作者对Cas/crRNA复合物的浓度、酶裂解时间和Mg²⁺浓度进行了优化。发现FAM和ROX的荧光强度随着circROBO1和BRCA1浓度的增加而增加（图3C）。实验发现，Cas13a/crRNA1和Cas12a/crRNA2复合物的最佳浓度分别为2.5 nM和10 nM，切割反应时间为30分钟，且FAM和ROX在Mg²⁺浓度为6 mM下获得较大的荧光信号，故CRISPR-Cas13a/Cas12a系统Mg²⁺的最佳浓度为6 mM。

研究者通过实验发现，circROBO1和BRCA1基因被CRISPR-Cas13a/Cas12a切割会产生显著的荧光信号，将circROBO1和BRCA1基因进行单碱基错配会减弱荧光信号，如三碱基错配或随机序列，则基本检测不出荧光信号（图4A-B）。随后，将不同浓度的circROBO1和BRCA1加入到100倍稀释的人血清样品中来研究其回收率，circROBO1的回收率为94%~104%，BRCA1的回收率为93%~104%，表明该检测的基质效应最小。

最后，用CRISPR-Cas13a/Cas12a系统检测健康供体和乳腺癌患者扩增的PCR产物中的circROBO1（图4C）。乳腺癌患者的荧光信号明显高于健康供体，表明乳腺癌患者的circROBO1水平上调。以上结果与qRT-PCR结果一致。随后，利用ROC曲线对健康供体(n=4)和乳腺癌患者(n=4)扩增的聚合酶链反应（PCR）产物中的circROBO1进行分析，曲线下面积（AUC）为0.875，证实所提出的方法具有良好的特异性和敏感性（图4D）。

本研究建立了基于CRISPR-Cas13a/Cas12a系统同时检测乳腺癌生物标志物circROBO1和BRCA1的荧光生物传感器。同步荧光扫描可以实现circROBO1和BRCA1的一步检测，检测限分别为0.013 pM和0.26 pM。该系统具有高灵敏度和特异性，对临床样本的检测具有较高的诊断潜力。此外，作者发现circROBO1通过ceRNA机制结合miR-498调控BRCA1，为乳腺癌的内在调控机制提供了可靠依据。该研究首次同时检测BC相关生物标志物circROBO1和BRCA1，为临床体液样本中生物标志物检测提供了可行方案。

参考文献：

[1] Tan C, Xie G, Wu S, Song C, Zhang J, Yi X, Wang J, Tang H. Simultaneous detection of breast cancer biomarkers circROBO1 and BRCA1 based on a CRISPR-Cas13a/Cas12a system. Biosens Bioelectron. 2024 Aug 15;258:116373. doi: 10.1016/j.bios.2024.116373. Epub 2024 May 8. PMID: 38729048.