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线粒体 DNA（mtDNA）突变在许多人类疾病中起着至关重要的作用。对携带 mtDNA 突变的细胞进行活体可视化对于解决这些疾病的复杂性非常重要。那么如何利用CRISPR技术实现在单细胞和动物模型中以高空间分辨率识别 mtDNA 突变呢？带着这个问题，随小编一起来看看下面的文章吧~
线粒体 DNA（mtDNA）的遗传或获得性突变导致多种人类代谢性疾病。mtDNA 突变主要是由于氧化磷酸化过程中产生大量活性氧以及线粒体中 DNA 复制的保真度较低。由于突变率高和修复能力受限，线粒体 DNA 通常处于异质体状态，致病突变的发生率很高。此外，获得性突变会在人的一生中不断积累，当达到阈值时，最终导致各种与衰老相关的疾病。尽管 mtDNA 非常重要，但由于难以在单细胞和动物模型中以高空间分辨率识别 mtDNA 突变，限制了对此类生物过程的研究。
原位滚环扩增（RCA）方法已被用于观察固定的单细胞或组织切片中野生型和突变型 mtDNA 的共存情况。通过对单个 mtDNA 进行高空间分辨率的基因分型，这些技术可以研究 mtDNA 的组织结构，从而为线粒体疾病的发展提供基础性见解。然而，由于多种酶的参与，原位 RCA 无法用于活细胞或体内研究。由于 mtDNA 的异质性会随着时间的推移而发生变化，因此有必要开发用于监测体内与疾病相关的 mtDNA 突变的探针。
近年来开发的 CRISPR 系统为追踪活细胞中的基因组动态提供了强大的分子识别工具。然而，它们大多使用 dCas9 对活细胞中的基因组位点动态进行成像，而单核苷酸变异（SNV）成像仍是一个挑战。为解决这一问题，作者倾向于关注其他亚型的 CRISPR 系统。其中，CRISPR/Cas12a 是一种 RNA 引导的酶，可以结合并切割目标 DNA，同时激活反式剪切活性，对附近的单链 DNA（ssDNA）分子进行无差别降解。这种能力已被用于构建高效的核酸诊断工具，如 SHERLOCK 和 DETECTR，以快速检测临床样本中的特定病原体。
最近，CRISPR/Cas12a 已被用于监测活细胞和体内的核酸、小分子、离子和其他生物标记物。例如，Song 等人介绍了一种嵌入有机框架的基于 CRISPR/aptamer 的传感器，用于体内 ATP 成像。Li 及其团队展示了一种用于 mRNA 体内时空成像的 CRISPR/Cas12a 生物传感器。然而，要检测 mtDNA 突变，Cas12a 探针需要有效地送入线粒体，Cas12a 识别 SNV 的特异性也需要进一步提高。此外，要实现对 mtDNA 突变的灵敏检测，还需要充分激活 Cas12a 在活细胞中的反式剪切活性。
在这项工作中，研究团队设计了一种集成的纳米Cas12a传感器（InCasor），它能够将Cas12a有效地递送到活细胞的线粒体中，用于识别靶mtDNA，从而激活Cas12a的反式剪切活性，切割共同递送的环状报告基团（CLR），产生强荧光信号，报告mtDNA突变（如图1a所示）。通过工程化改造crRNA，InCasor可以特异性地识别目标 mtDNA 中的 SNV。此外，通过在细胞环境中提供足量的 Mg2+，Cas12a 的反式剪切活性可以大大增强，从而放大活细胞内的检测信号。作者证明了 InCasor 能够识别体内的 mtDNA 突变，因而在各种生物和生物医学应用中显示出巨大的潜力。
由于Cas12a是一种金属依赖的内切酶，研究团队首先测试了一系列二价金属阳离子(Zn2+， Cu2+， Co2+， Fe2+， Ca2+和Mg2+)对LbCas12a的ssDNA裂解活性的影响。结果显示，Mg2+支持LbCas12a的最高反式裂解活性(图1b，顶部)，荧光信号随着Mg2+浓度的增加而增加(图1b，底部)。与文献报道一致，Mg2+对激活其反式裂解活性至关重要。
随后，研究团队利用滚环扩增反应合成多功能 DNA 纳米载体，其序列包含具有肿瘤细胞靶向性的 Sgc8核酸适体和线粒体膜靶向的细胞色素 C核酸适体（Cyt C apt），通过碱基互补高效装载环状报告基团和Cas12a/crRNA 复合体（图1c-f）。成功合成纳米探针后，首先使用体外荧光测定法对InCasor检测靶向mtDNA的反应动力学进行了表征，结果显示reporter快速裂解，且荧光强度随时间持续增加；透射电镜图也可以观察到InCasor识别目标DNA有明显的自剪切（图1f-g）。
为了评估InCasor成像活细胞mtDNA的适用性，研究团队对其内吞作用、溶酶体逃逸和线粒体靶向能力进行了系统研究。共聚焦图像和Bio-TEM成像显示，含有Sgc8和Cyt C apt的InCasor被HepG2细胞有效摄取，并与线粒体共定位良好 (图2a-c)。为了进一步测试InCasor将Cas12a RNP传递到线粒体的能力，研究团队在分离的线粒体中表征InCasor探针中的每个组分。蛋白酶保护实验、共聚焦成像、流式分析线粒体提取物中双阳性线粒体的比例，结果均表明InCasor探针可以将Cas12a蛋白和crRNA传递到活HepG2细胞的线粒体中。然后，研究团队在InCasor对线粒体稳态的影响方面展开了研究。如图2f-h所示，当使用InCasorCyt C apt+处理细胞时，线粒体膜电位降低、通透性明显增加。结果表明，InCasor可能通过破坏线粒体稳态来促进Cas12a RNP复合物进入线粒体。
InCasor的另一个重要功能是增加细胞内的Mg2+浓度，从而激活Cas12a的反式切割活性。DNF主要由DNA和焦磷酸镁(Mg2PPi)组成，可在溶酶体的酸性环境中释放Mg2+。ICP-MS被用于表征InCasor处理的HepG2细胞内Mg2+浓度，其显示出比未处理的对照组增加约2倍。并且DNA纳米载体对Mg2+的改变在处理6 h后并没有显著改变细胞活力。更重要的是，InCasor可以将大量Mg2+输送到细胞中。在去除InCasor处理后，由于细胞内固有的Mg2+调节机制，细胞内Mg2+水平会随着时间的推移而降低，从而维持细胞内Mg2+的稳态。
为了评价InCasor对活细胞mtDNA的检测能力，研究团队针对mtDNA ND4基因构建InCasor探针。共聚焦和流式均检测到明显的荧光信号(图3a-c)。WB和qPCR实验结果也表明Cas12a在特定位点发生了剪切。此外，全基因组测序结果表明InCasor未在HepG2细胞的核基因组及线粒体基因组中产生功能性脱靶。为了证明提供额外的Mg2+在激活活细胞中Cas12a/crRNA的反式切割中的重要性，研究团队用Co2+代替封装的Mg2+制备了另一个InCasorND4-Co2+探针。尽管这两种探针都显示出有效的线粒体靶向和mtDNA基因沉默能力(图3d)，但InCasorND4-Co2+探针在活的HepG2细胞中没有产生明显的荧光信号(图3e-f)，这表明充足的Mg2+供应对于激活活细胞中Cas12a/crRNA的反式切割活性至关重要。为了进一步检验是否有必要提供额外的Mg2+，用InCasorND4-Co2+探针处理的细胞与含有不同浓度Mg2+的DPBS孵育。然后用CLSM检测细胞内Mg2+水平和InCasorND4-Co2+的mtDNA感知能力。结果显示，Mg-Fluo-4 AM的强度和HepG2细胞中Cy3的强度都随着DPBS中Mg2+浓度的增加而增加(图3 g-j)。Cy3强度与Mg-Fluo-4 AM的相关性分析显示，InCasorND4-Co2+的感知能力与细胞内Mg2+水平呈正相关(图3k)。总的来说，这些数据表明细胞内Mg2+水平的增加有助于细胞内触发Cas12a的反式切割活性。
接下来，研究团队考察了InCasor是否可以用于在细胞层面区分具有不同基因型mtDNA的细胞。由于Cas12a与dsDNA结合需要PAM序列，因此研究团队假设InCasor可利用PAM识别机制来识别活细胞中具有特定mtDNA突变的线粒体。为了验证这一想法，经过测序之后，团队在MDA-MB-231细胞的ND4基因中鉴定了一个单碱基突变，并针对突变序列设计了一个PAM来诱导Cas12a/crRNA结合（图4a-f）。研究团队合成了针对这个突变位点的的InCasor探针，并使用体外切割试验和单细胞成像分析进行了测试，流式和共聚焦结果都证明了InCasor在突变型细胞中识别PAM序列单碱基突变的能力。
为了进一步扩大InCasor探针的序列适用性，研究者找到了检测MDA-MB-231细胞中一个PAM邻近的单碱基突变位点并设计了相应的探针（图4g）。体外荧光分析表明，使用完全匹配crRNA时，无法区分野生型与突变型的mtDNA。因此，团队通过在SNV位点附近添加错配来改造crRNA，希望能够提高特异性。当分别有1个和2个核苷酸错配的时，探针的特异性大大提高，检测灵敏度没有显著损失。共聚焦数据也显示，改造的探针能够在异质细胞中区分MT-Mito和WT-Mito。这说明可以通过crRNA修饰提高InCasor的序列适用性。
图4. InCasor用于活细胞中 mtDNA 突变成像
而探针在单个线粒体中产生的离散信号表明，该传感器在研究两种线粒体在异质细胞中的分布方面具有潜在的用处。为了验证这一潜力，团队首先通过从MDA-MB-231细胞中分离线粒体并将其转染到HepG2细胞中，创造了含有异质mtDNA的细胞（图5）。当细胞与较多的MT-Mito孵育时，胞质中出现较多的绿色荧光信号，说明MT-Mito转染成功。当用InCasor处理异质性细胞时，可以观察到由探针产生的相应的Cy5荧光信号。统计分析显示绿色和紫色信号同步增加，并保持高效共定位，这表明InCasor可以直观地区分异质细胞中具有不同mtDNA谱的单个线粒体。
图5. InCasor 用于活体异质细胞中 mtDNA 突变的成像
对mtDNA中的SNV突变进行活体成像是一个长期追求的目标，但以前从未实现过。InCasor 的一大优势是其集成的纳米结构，这为携带 mtDNA 突变的组织的体内成像提供了潜力。为了测试InCasor在体内成像mtDNA突变的能力，研究团队构建了双侧瘤小鼠模型，分析了尾静脉注射改造前后的探针产生的荧光信号变化（图6）。改造前,双侧肿瘤组织中均观察到明显的荧光信号。这说明其SNV识别特异性低, 这与前面的活细胞成像结果一致。相比之下，改造后的探针仅在突变型的肿瘤中产生明显的荧光信号，表明InCasor能够在小鼠模型中成像mtDNA单碱基突变。
值得注意的是，在小鼠的肝脏部位也可以观察到明显的荧光信号，因此研究者解剖了图6E中使用的小鼠，并进行了组织切片成像。研究者在肝脏表面发现了明显的白色结节，可能是肿瘤转移灶。解剖肝组织的体外成像显示明显的荧光信号。HE染色示肝组织内典型的肿瘤转移灶。通过免疫组化染色，绿色荧光标记正常肝细胞，在2个不同的肝组织切片上观察到红色和绿色荧光明显分离。这些发现表明，InCasor能够监测小鼠体内含有突变型mtDNA的肿瘤及其转移灶。
图6. 利用 InCasor 对小鼠模型中的 mtDNA 突变进行体内成像
参考文献：
[1] Li, Y., Wu, Y., Xu, R. et al. In vivo imaging of mitochondrial DNA mutations using an integrated nano Cas12a sensor. Nat Commun 14, 7722 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43552-0
