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逆转录策略虽然弥补了Cas12a在RNA靶标识别中的局限性，并在RNA检测中广泛应用，但这种方法仍存在诸多弊端。科学家们在不需要逆转录的检测方法中做了诸多的探索，本文献的研究者们有什么新点子呢？我们一起来看看吧~
这篇文章来自华中科技大学同济医学院研究团队，题为“A universal and specific RNA biosensor via DNA circuit-mediated PAM-independent CRISPR/Cas12a and PolyA-rolling circle amplification”，2023年发表在Biosensors and Bioelectronics杂志上。在该研究中作者建立了一种简单、低成本、高灵敏度的RNA检测方案，命名为DCPRBiosensor，其检测限能达到100 aM，并且在100 aM和10 pM之间呈线性关系。此外，该技术能消除PAM限制，且对单碱基错配具有良好的辨别能力。
DCPRBiosensor生物传感器由3个模块组成：PolyA滚环扩增（PolyA-RCA）、DNA circuit和CRISPR/Cas12a（图1）。首先，作者设计了PolyA-RCA扩增，使用扩增产物作为Input信号，启动DNA circuit将特定的RNA信号转化为包含toehold区域的三重复合体信号。然后，通过链置换激活CRISPR/Cas12a产生反式剪切荧光信号。
图1. DCPRBiosensor基本原理
在之前的研究中，作者已经证明CRISPR/Cas12a可以识别并结合含有toehold的dsDNA（toe dsDNA），可在不需要PAM序列的情况下激活其自身的反式剪切活性[1]，见图2。
图2. Cas12a以不依赖PAM的方式识别toe dsDNA
基于以上发现，作者在本研究中设计了DNA circuit元件，由启动子Promotor和阻断剂Blocker组成（图3c）。在Promotor上主要有三个功能区域：迁移区、Toehold区和crRNA结合区；Blocker用于阻断Promotor与crRNA的结合。当有特定ssDNA输入时，ssDNA与Blocker竞争结合Promotor，因为在Promotor/Blocker复合物中有一个气泡（气泡是不稳定的），因此ssDNA竞争力比Blocker更强。导致Blocker从迁移区和Toehold区分离，形成ssDNA/Promotor/Blocker三重复合体。然后，crRNA通过三重复合中间体的Toehold区结合Promotor，激活CRISPR/Cas12a（图3d-e）。从DNA circuit元件的作用原理中可以看出，ssDNA输入信号不需要PAM序列。因此，该方案可以用于检测ssDNA靶标，且只需要替换Promotor和Blocker就能检测不同的ssDNA靶标。
接下来，作者验证了输入（ssDNA）可通过DNA circuit成功激活CRISPR/Cas12a，产生荧光信号（图3f）；并研究了迁移区长度和气泡位置对DNA circuit和CRISPR/Cas12a模块功能的影响。结果表明，当迁移区为5 nt时，信噪比达到最大值69.65（图3g）；当气泡位置在+6时，信噪比达到最大值110.09（图3h）。
piRNA（Piwi-interacting RNA）是一类内源性小干扰RNA，长度为24-32 nt。大量研究表明，多种疾病与piRNA的异常表达相关。因此，piRNA的检测对于指导疾病的诊断、监测和预后评估至关重要。因此，本文作者选择piRNA作为检测目标。利用优化后的条件检测piR-823，作者发现该方案的检测灵敏度可达1 pM，充分证实了该方案的可行性（图4）。
图4. DCPRBiosensor检测piR-823
为了进一步提高检测灵敏度，作者设计了一种特异性的PolyA-RCA，以挂锁的RNA结合区作为目标序列，启动DNA circuit元件。根据之前的研究报道，传统RCA背景噪音主要是由于挂锁探针（Padlock）自身之间或挂锁探针与引物之间的非特异性结合，导致非特异性环化。为了避免这种背景干扰，作者设计了特异性的PolyA-RCA：PolyA挂锁探针的目标序列与RNA特异性结合，非靶标序列设计为PolyA结构（图5a）。PolyA碱基序列单一，能大大降低了RCA背景且无需清除冗余的挂锁探针。另外，值得注意的是，有研究表明，在RCA扩增中使用Bst比Phi29表现出更好的特异性和重复性。因此，作者选择Bst作为RCA扩增的DNA聚合酶。变性聚丙烯酰胺凝胶证实，相较于传统的挂锁探针（conventional padlock），PolyA-padlock背景更加干净（图5b）。接下来，作者将PolyA-RCA或传统RCA与DNA circuit和CRISPR/Cas12a连接起来，测试检测性能（图5c）。结果表明PolyA-RCA的信噪比为369.27，而传统RCA的信噪比分别为35.46和15.21（图5d-e）。综上所述，PolyA-RCA大幅度提升了检测信噪比，具有良好的传感性能。
图5. DCPRBiosensor结合PolyA-padlock提高信噪比
紧接着，作者还对 DCPRBiosensor检测体系进行了条件优化，包括PolyT引物长度、 PolyA-padlock与PolyT引物的浓度比例等。结果表明，PolyT引物长度14-17 nt均可；PolyA-padlock与PolyT引物的浓度比值为1：2.5时，效果最佳；T4连接酶的处理时间3 h最佳；CRISPR/Cas12a的浓度为18 nM时，信噪比最高达到404.86。在以上优化后的条件下进行检测，DCPRBiosensor传感器的检测限可达到100 aM，且在100 aM~10 pM范围内呈线性关系（图6a-c）。
图6. DCPRBiosensor检测系统优化
然后，作者选择另外三个piRNAs作为靶点：piR-33733、piR-14633和piR-52207，并设计了相应的启动子、阻断剂和RCA系统。使用DCPRBiosensor传感器分别检测piR-33733、piR-14633和piR-52207，结果表明，piR-33733的检测限为100 aM，线性范围为100 aM~10 pM；piR-14633和piR- 52207的检测限为1 fM，线性范围为1 fM~1 pM（图7a-b）。随后，作者进一步检测了DCPRBiosensor的特异性。采用与piR-823有单碱基不匹配的piRm1、piR-m2、piR-m3和piR-m4作为干扰物。结果表明，DCPRBiosensor传感器能明显区分piRNA-m1和piRNA-m2，而对piRNA-m3和piRNA-m4的区分能力较弱（图7c-d）。这说明DCPRBiosensor能够很好地区分部分关键区域的单碱基错配，区分能力与错配位点的位置有很大关系。
为了测试DCPRBiosensor传感器在复杂生物样本中的实用性，作者检测了细胞样本。据报道，piR-823在结直肠癌细胞系DLD-1和HCT-116 c中高表达。因此，作者选择DLD-1和HCT-116细胞进行实际样本分析，并以宫颈癌SiHa细胞系作为对照组。通过提取细胞样本，分离总RNA，最后使用DCPRBiosensor传感器检测piR-823（图8a）。结果表明，HCT-116细胞系呈阳性，而在SiHa细胞系中呈阴性；该结果与RT-qPCR一致（图8b-c）。此外，为了更接近临床样本，作者混合了浓度为1 nM、1 pM和0的合成piR- 823与正常人类尿液作为模拟样本。然后使用DCPRBiosensor传感器检测这些尿液样本中的piR-823，结果表明，可在4.5 h内在尿液混合物中检测低至1 pM的piR-823。本文还探索了该方案在活细胞中进行检测的可能性，即在H293T细胞中进行piR-823检测（图8d）。
图8. DCPRBiosensor检测实际样本中的piRNA
综上所述，作者建立了一个DNA circuit介导的不依赖PAM的CRISPR/Cas12a检测方案。除了简单、低成本外，DCPRBiosensor传感器还具有高灵敏度、高特异性和普适性等优势。同时，采用与传统挂锁探针模式不同的PolyA-RCA策略，大幅度提高了信噪比。作者用DCPRBiosensor传感器成功鉴定了四种不同类型的piRNAs，验证了其普适性和稳定性，且该方法对单碱基错配具有良好的识别能力。最后，作者在4.5 h内检测了细胞和模拟尿液混合样本中的piRNA。虽然目前DCPRBiosensor传感器的测试时间可能不能完全满足POCT的需求，但或许可以通过多种方式缩短检测时间，包括选择更好的连接酶或HCR和CHA等。因此，DCPRBiosensor传感器可能对CRISPR/Cas12a的应用发展和piRNA临床研究具有积极影响。
由于CRISPR/Cas12a对ssDNA靶标的识别不依赖PAM，因此已有很多研究将RCA扩增与Cas12a结合用于DNA/RNA检测，核心思路是用靶标核酸作为引物或互补链，启动Padlock探针的连接成环（需要T4连接酶）和滚环扩增（需要phi29酶/Bst酶和dNTP），产生的长链ssDNA产物含有重复的靶标序列，作为Cas12a/crRNA识别底物激活其反式剪切，产生信号。然而，RCA容易发生非特异性扩增，主要原因在于Padlock探针本身或Padlock探针与引物之间的非特异性结合，从而导致低信噪比或假阳性。
参考文献：
[1].Zhang W, Mu Y, Dong K, Zhang L, Yan B, Hu H, Liao Y, Zhao R, Shu W, Ye Z, Lu Y, Wan C, Sun Q, Li L, Wang H, Xiao X. PAM-independent ultra-specific activation of CRISPR-Cas12a via sticky-end dsDNA. Nucleic Acids Res. 2022 Dec 9;50（22）:12674-12688.
[2].Wang S, Li H, Dong K, Shu W, Zhang J, Zhang J, Zhao R, Wei S, Feng D, Xiao X, Zhang W. A universal and specific RNA biosensor via DNA circuit-mediated PAM-independent CRISPR/Cas12a and PolyA-rolling circle amplification. Biosens Bioelectron. 2023 Apr 15;226:115139.
