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猪链球菌病是一种人畜共患病，给养猪业造成重大经济损失，且严重威胁公众健康。如何通过CRISPR-Cas12a 技术实现猪链球菌病的现场快检呢？大家带着这个问题，随小编一起来看一下研究者们有怎样的探索吧~
猪链球菌病是由多种致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病。到目前为止，共有35个血清型(1~34，1/2型)，最常见的致病血清型为2型，可导致猪和人类脑膜炎、败血症、心内膜炎等，如果诊断、治疗不及时，预后较差，病死率极高。猪链球菌2型给养猪业造成重大经济损失，严重威胁公众健康，所以开发一种准确、快速的检测方法对于疫情防控具有重要意义。
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究团队在Talanta上发表了题为“A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2”的文章。报道了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和猪链球菌短回文重复序列CRISPR-Cas12a系统的高保真检测和血清分型平台（Cards-SSJ/K）。Cards-SSJ检测限为101 CFU/反应，耗时＜60 min，与猪链球菌的其他血清型、密切相关的链球菌属或常见猪病原体均没有交叉反应；Cards-SSK可区分血清2型和血清型1/2型。Cards-SSJ与qPCR对组织样本中猪链球菌血清型2的检测结果一致。Cards-SSJ耗时较少，对设备和人员要求较低，是猪链球菌血清2型现场检测、即时检测的可行方案。
首先，通过商用试剂盒从临床组织样本/拭子中提取基因组DNA，并通过RPA在37℃、15分钟扩增目标DNA。然后将RPA产物转移至CRISPR-Cas12a反应系统。反应体系中的CRISPR-Cas12a与靶标结合后，激活反式剪切活性，切割荧光探针，释放荧光信号。检测样本中若无靶标存在，不能激活CRISPR-Cas12a的反式剪切活性，荧光探针保持完整，无荧光信号产生。最后，可通过酶标仪测定荧光信号，判断样本是否为确定猪链球菌血清2型阳性；或可通过肉眼观察，在蓝光下或者试纸条上判断样本是否为猪链球菌血清2型阳性（图1），检测过程耗时＜1 h。
RPA引物和crRNA的设计在基于RPA和CRISPR/Cas12a的靶向检测体系中发挥着重要的作用。作者根据猪链球菌血清2型cps2J基因的特异性设计了4条RPA引物和可识别cps2J基因的20个不同区域的4条crRNA（图2A）。经筛选，crRNA 174、RPA引物F1/R1组合的荧光值相对较高（图2B），后续实验采用引物对F1/R1 （0.48μM）和crRNA 174 （50 nM）。最终优化的CRISPR/Cas12a反应体系（20 μL)含有1 × NEBuffer 2.1、2 μL RPA产物、1000 nM ssDNA报告探针（图2C）、50 nM LbCas12a、50 nM crRNA（图2E）。
为了证实该方法的特异性，作者将cps2J基因RPA扩增子（302 bp）序列在NCBI数据库中进行BLAST检索，只发现了针对猪链球菌的显著匹配。RPA引物对猪链球菌血清2型也表现出很高的特异性。此外，作者还使用Cards-SSJ对12种常见猪病原体（图3A）和29种不同的猪链球菌血清型菌株，2种猪链球菌样菌株的基因组DNA（图3B），以及 10个链球菌属相关菌株（图3C）进行了测试，结果显示，使用优化的crRNA和RPA引物组合，未发现以上菌株间的交叉反应，但与猪链球菌血清型1/2间存在交叉反应（图3B）。综上，结果表明Cards-SSJ对猪链球菌血清2型和血清1/2型显示出高特异性。此外，作者还确定了Cards-SSJ的检测限，qPCR法与Cards-SSJ （图3F）的LoD相当，都能检测101 CFU/反应。
由于Cards-SSJ也能检测到猪链球菌血清1/2型菌株，作者进一步开发了特异性的检测方法来区分猪链球菌血清2型和1/2型。猪链球菌血清2型和1/2型cpsK基因的483位点（G→T）为一个SNP位点（图4A）。为了进一步筛选合适的crRNA，作者设计了14对PCR引物，其中7对针对正义链483→G位点的引物（图4B），7对针对反义链的483→C位点的引物（图4 C），所有上游引物均包含PAM序列。作者设计了14个PAM序列和SNP位点被0-6个碱基分开的crRNA，靶向正义链和反义链。结果表明，在突变位点上游第5个碱基插入PAM序列时，在相同的孵育时间下，两种血清型的荧光强度比例最高（血清2型/血清1/2型 = 2.55 ）（图4D，E）。虽然上述优化后条件增加了检测特异性，但仍不足以区分两种血清型的猪链球菌。因此，作者根据cps1/2K 483→T位点重新设计了crRNA和RPA引物，PAM序列与T位点相隔5个碱基（图4F）。通过调整正反向引物浓度比例，结果显示，猪链球菌血清1/2型的荧光强度比血清2型高出10倍。最终可实现通过检测荧光强度（图4G）或观察绿色荧光（图4H），快速进行猪链球菌血清分型。猪链球菌血清1/2型可产生绿色荧光，而在含有猪链球菌血清2型的Cards-SSK体系中则没有检测或观察到荧光信号。
为了评估Cards-SSJ的性能，作者提取了53份猪不同组织样本和51份小鼠肺样本的基因组DNA，使用Cards-SSJ法、PCR和qPCR法进行检测。在104份组织样本中，Cards-SSJ法检出阳性72例，qPCR法检出阳性71例，PCR法测出阳性31例。在Cards-SSJ法盲试中，78个临床猪链球菌分离株中的57个血清2型菌株被正确检出，与PCR和测序结果一致（图5）。
图5. Cards-SSJ在猪链球菌临床分离株检测中的应用
本研究将RPA与CRISPR-Cas12a相结合，构建了猪链球菌血清分型快速检测平台Cards-SSJ/K，该平台可在60分钟内通过肉眼读取信号，区分猪链球菌血清2型与血清1/2型，可实现在养殖场等环境下的及时、便捷、简单的实地检测。此外，该法也适用于实验室条件的高通量酶标仪信号检测。在组织样本及临床样本中，Cards-SSJ法和qPCR法的检出率一致，且远高于PCR法。因此，Cards-SSJ/K因其简单、快速、便捷，是猪链球菌血清分型现场快检的可行方案。
参考文献：
[1] Lu Wan, Jing Sun, Jiyu Zhao, Jieyu Bai, Yueling Zhang. A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2. Talanta. 267(2024)125202. doi: 10.1016/j.talanta.2023.125202.
