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耐药菌，超级耐药菌等问题是重要的全球性医疗健康议题之一，对耐药菌的实时监测具有实际且重要的临床意义。CRISPR技术为资源匮乏地区或护理点现场快检提供了可行方案。针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）这一常见耐药菌，研究者们怎样借助CRISPR-Cas12a的优点，实现临床快检平台的构建呢？我们一起来看看今天的文章吧~
抗菌素耐药性（AMR）是全球医疗保健中最紧迫的问题之一。随着抗生素的使用，耐药菌的不断出现，特别是“超级耐药菌”的报道引起了全世界对细菌耐药性问题的关注。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是医疗机构中常见的AMR感染菌株，会导致皮肤和血液感染，死亡率和发病率较高。传统的细菌培养法为临床MRSA的标准检测方法，耗时较长，数天到数周不等。近年来，核酸扩增检测法（NAATs）已应用于MRSA检测，检测可在一天内完成，其中PCR检测法虽然是金标准，但其对专业仪器及专业操作的依赖性，限制了其在资源匮乏地区、护理点现场及时检测等场景中的应用。等温NAATs法（如环介导等温扩增、滚环扩增等），虽可实现现场及时检测，但其无法对核酸靶标实现精确的SNP检测。对于MRSA，SNP检测在其疾病监测、流行病学研究中起着至关重要的作用。CRISPR-Dx技术的兴起，为MRSA的临床快检提供了优秀的解决方案。
Akkapol Suea-Ngam团队在“An amplification-free ultra-sensitive electrochemical CRISPR/Cas biosensor for drug resistant bacteria detection”一文中报告了基于CRISPR-Cas12a系统的无扩增电化学CRISPR/Cas生物传感器，实现了MRSA飞摩尔水平的无扩增基因检测，及SNP检测。该法在临床耐药菌及时监测等方面应用前景广阔。
作者将mecA基因作为MRSA检测靶标，设计了一种新型银增强E-CRISPR生物传感器（E-Si-CRISPR）。靶标基因mecA存在时，Cas12a-gRNA复合物结合靶基因，行使顺式切割功能，并启动反式切割活性，从而切割电极表面的ssDNA。当mecA靶标不存在时，电极表面ssDNA保持完整。随后进行银金属化过程，Ag+和带负电的ssDNA之间的静电作用可使Ag+与DNA结合，银离子沉积量与电极表面ssDNA剩余量成正比，读取电化学信号差异进行mecA相关检测。
作者首先通过循环伏安法（CV）、方波伏安法（SWV）、电化学阻抗谱（EIS）和库仑法测试了MCH（6-巯基1-己醇）修饰电极、ssDNA修饰电极、Cas蛋白处理电极的性能差异（图1）。作者通过CV法，比较了电极上30 nt ssDNA在金属化前后的氧化还原信号差异（图1a）。结果证实，银金属化后，ssDNA电极的电活性面积增加。随后作者通过SWV法测量电极上切割后和完整ssDNA的信号差异（图1b）。完整的ssDNA（即阴性结果）状态下，能检测到较大的电流信号（100%），而切割后的ssDNA能检电流信号降低，仅检测到30%电流信号输出（即阳性结果）。作者通过ESI法监测了ssDNA修饰电极（有/无Cas12a处理）的银金属化反应信号差异，并与MCH修饰电极的结果进行了比较。如图1c所示，MCH修饰电极电子转移电阻的变化（Rct值）较小，表明[Fe(CN)6]3-/4-离子可快速迁移到电极界面。Cas12a处理ssDNA修饰电极后的Rct值与MCH修饰电极仅略有不同，表明ssDNA成功被反式切割，在电极表面仅留下了MCH和残余的ssDNA。作者观测到未经Cas12a处理的ssDNA修饰电极银金属化后半圆形结构域消失，该结果表明未经Cas12a处理的ssDNA修饰电极被银完全金属化。作者最后采用库仑法证实了Cas12a处理，可去除ssDNA修饰电极表面70%的寡核苷酸。由于SWV法背景信号低，氧化还原峰差异显著，显示出优异的灵敏度，作者选用SWV法并进行最佳参数优化，结果表明最佳参数值为10 mV跨步电压、200 Hz频率和60 mV振幅。作者通过银金属化后的ssDNA修饰电极和三重Cas12a处理后ssDNA修饰电极之间电化学信号的百分比差异进行靶标定量分析。接下来，作者优化了MgSO4浓度、三重Cas12a浓度、反式切割孵育时间、ssDNA长度和ssDNA浓度等条件参数。结果显示，MgSO4浓度为20 mM时信号稳定（图2d），Cas12a孵育45分钟进入反应平台期（图2e），Cas12a较适浓度为50 nM（图2f），30 nt长度的ssDNA表现优异。
图2. 传感器的检测条件优化
通过上述优化，作者构建了用于mecA检测的E-Si-CRISPR生物传感器。其线性范围跨越5个数量级（10 fM ~ 0.1 nM, R2 =0.988, 图3b），检测限3.5 fM。相较于金标准PCR法，E-Si-CRISPR传感器在更短的时间内（90分钟）即可实现出色的靶标分析性能，无需核酸扩增，使用便携式仪器检测，并能同时实现出色的SNP区分能力。
图3. E-Si-CRISPR生物传感器检测性能
由于MRSA导致伤口皮肤感染并最终感染血液，因此作者测试了E-Si-CRISPR对人血清样本的检测能力。与缓冲液对照样本相比（17.1 %/log nM，R2 = 0.988），血清样本校准曲线（15.5%/log nM，R2 = 0.946）显示出较小的差异，电化学信号略有下降。为了评估人血清结果的重复性，作者比较测试了三种mecA基因浓度（1、10和100nM）的结果。如图3d显示，血清样本与对照间无显著差异。合适的酶孵育时间及银金属化间电极清洗等有助于提升检测相关性。E-SiCRISPR方法在人血清样本检测中，表现出优异的分析性能。
作者研究了E-Si-CRISPR传感器检测单碱基突变差异的能力。作者在PAM的2号位点，及目标序列的1、5、10位点引入单碱基错配，结果证实PAM序列单碱基错配明显降低检测信号，距PAM越远，单碱基突变信号差异越不明显，目标序列10号位点错配（mmG10），与野生型（WT）目标序列无显著信号差异。该结果证实了E-Si-CRISPR基于PAM序列的单碱基突变检测能力。
为了测试ESi-CRISPR的准确性，作者对不同浓度mecA基因（0.1、1和10pM）进行了检测，并与PCR法进行比较。如图5a所示，两种方法之间没有显著差异，表明E-Si-CRISPR为mecA基因分析提供了可靠的准确性。此外，通过使用10 pM样品重复10次测试，ESi-CRISPR显示出优异的精密度。
图4. E-Si-CRISPR单碱基突变检测
作者选用大肠杆菌、粪肠球菌、单核增生乳杆菌、表皮葡萄球菌和甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）与MRSA，进行E-Si-CRISPR菌株区分测试，如图5b所示，E-Si-CRISPR显示出优异的MRSA特异性。此外，作者比较测试了E-Si-CRISPR与PCR对血清样本中MRSA的检测能力。对含102 MRSA拷贝的血样检测结果表明，ΔI检测信号维持在30%，图5b中的所有非MRSA靶标ΔI检测信号均低于15%。结果证实了E-Si-CRISPR在临床相关水平上检测MRSA的可行性。作者还测试了E-Si-CRISPR的存储稳定性（图5d）。
图5. 细菌样本检测性能分析
作者构建了一种基于CRISPR-Cas12a系统的无扩增电化学CRISPR/Cas生物传感器（E-Si-CRISPR），实现了MRSA飞摩尔水平的无扩增基因检测，及SNP检测。LOD为3.5 fM，线性范围在10 fM至100 pM之间。E-Si-CRISPR检测结果与金标准PCR法检测结果无明显差异；在人血清中，E-Si-CRISPR保持优异的分析性能。此外，E-Si-CRISPR可实现单碱基错配区分。在细菌样本特异性检测中，E-Si-CRISPR成功将MRSA与其相似菌株进行了区分。E-Si-CRISPR以其高灵敏度、选择性、准确性、精密度和稳定性，在MRSA临床检测中有极大的应用潜力。
参考文献：
[1] Suea-Ngam A, Howes P D, Demello A J. An amplification-free ultra-sensitive electrochemical CRISPR/Cas biosensor for drug-resistant bacteria detection. [J]. Chemical Science, 2021.12(38): 12733-12743. DOI: 10.1039/d1sc02197d
