TOLO智库 | 不依赖PAM序列，CRISPR-Cas12a能超特异性靶向dsDNA吗？

CRISPR-Cas12a结合预扩增技术在生物传感中具有高灵敏度的优势，但特异性及通用性成为CRISPR-Cas12a在实际应用中的重要制约因素。实际应用中，理想的CRISPR-Cas12a系统应具备通用性的识别任意靶标DNA序列的能力及区分靶标DNA与干扰序列的特异性。Cas12a能特异性识别并剪切带PAM（5'-TTTN-3'或5'-TTN-3'）的双链DNA（dsDNA）靶标，使DNA双链断裂并生成黏性末端。对单链DNA（ssDNA）靶标的识别和剪切不依赖PAM序列。以上机制表明，CRISPR-Cas12a的通用性仅限于ssDNA，但其特异性较差。在基于CRISPR-Cas12a的检测系统中，研究人员通常需要将待检测的靶标链设置为ssDNA。如果靶标链必须是dsDNA，则需要通过酶法等方法使其成为单链。这种在靶标序列通用性上的局限性不仅使识别靶标范围受限、牺牲了操作程序化便捷度，而且进一步降低了CRISPR-Cas12a的靶标特异性。区分单碱基差异干扰链的能力是评估检测系统特异性的一个重要标准。虽然可以通过调整CRISPR-Cas12a种子结构域内的错配位点来识别dsDNA中的单碱基错配，但该法实用效果并不理想。当CRISPR-Cas12a作用于ssDNA时，其区分单碱基错配的能力变得更差。即使采用添加竞争性短阻断链（~20nt）的方法，差异系数也仅略微提高到1.6至3.9倍。已报道的CRISPR-Cas12a识别dsDNA或ssDNA中单碱基错配的能力尚未能满足临床检测的需要。因此，迫切需要在保持CRISPR-Cas12a系统高灵敏度的同时，扩大其通用性，大幅提高其特异性。

华中科技大学肖先金团队深入研究了CRISPR-Cas12a与底物DNA之间的相互作用，发现了一种新的CRISPR-Cas12a靶向底物，即粘性末端dsDNA（PAM⁻SE⁺ dsDNA）。CRISPR-Cas12a对该底物DNA具有特殊的酶学特性，即在不需要PAM序列的情况下识别和切割dsDNA的能力，以及对该底物DNA内单碱基错配的高敏感性。研究论文“PAM-independent ultra-specific activation of CRISPR-Cas12a via sticky-end dsDNA”发表在Nucleic Acids Research期刊。研究团队通过PAM⁻SE⁺ dsDNA靶向底物，提高了CRISPR-Cas12a的特异性和通用性，并发现CRISPR-Cas12a低温激活现象，偶联低温及PAM⁻SE⁺ dsDNA靶向底物，成功构建了实际样本低丰度单碱基突变检测新方案。

为了探索CRISPR-Cas12a对底物的催化效率，研究者首先检测了CRISPR-Cas12a对经典底物（图1A）的靶向识别作用，结果表明CRISPR-Cas12a对经典底物具有较高的催化效率（图1B）。但是当底物存在单碱基差异时，CRISPR-Cas12a对底物的特异性非常差，DF值（discrimination factor，单碱基差异的目标链与干扰链的荧光增长率之比）不超过4.3（图1C-E），远低于临床需求。要解决特异性较差的问题，关键在于发现CRISPR-Cas12a新的识别行为，而研究者发现的CRSIPR-Cas12a新底物（粘性末端dsDNA），为CRISPR-Cas12a识别靶向链提供了新的方案。研究者发现CRISPR-Cas12a对粘性末端dsDNA的识别效率与起始区（initiation region，没有互补DNA链但与gRNA互补的区域）长度有关（图1F，G），在合适的起始区长度下（~5nt），其识别效率和经典底物的识别效率相当。随后，研究者进一步研究了CRISPR-Cas12a对不同PAM⁻SE⁺dsDNA的识别通用性。如图1H所示，CRISPR-Cas12a成功识别了所有7个随机设计的PAM⁻SE⁺dsDNA，反应速率极快，证实了CRISPR-Cas12a对粘性末端dsDNA识别具有通用性。

为了进一步增强CRISPR-Cas12a的特异性，研究者采用“双错配对单错配”策略，人工改变了gRNA的一个碱基，使得其与靶向PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA（粘性末端dsDNA）形成一个单碱基错配，并与干扰PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA形成两个单碱基错配（图2A，B）。使用此策略区分单碱基差异的PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA dsDNA底物，DF值提高到了30.9-631.5（图2C），并且可以将低丰度靶标链的检出限降低至0.5-0.1%（图2D，E，F）。而即使同样使用“双错配对单错配”策略，经典的含PAM的dsDNA底物，则只能将DF值提高至4.9-50。这进一步表明， CRISPR-Cas12a对PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA中发生的序列改变更为敏感。

研究人员通过多种不同的荧光基团与淬灭基团标记方法，对这种底物的剪切机制进行了更深入的研究，认为gRNA和PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA将形成triplex flap结构，并随后被激活CRISPR-Cas12a切割dsDNA的两条链，且切割位置与经典的dsDNA底物的位置完全一致（图3D）。据此，研究人员对发现的特殊特异性的机制进行了推测：在该triplex-flap结构中，gRNA与T链（不与gRNA配对的DNA链）之间的竞争处于热力学平衡状态（ΔG≈0），因此对序列的改变非常敏感，即使是微小的序列改变也会使T链获得竞争优势，这会被Cas12a敏锐地识别出来（图3E）。

为了促进CRISPR-Cas12a系统在低丰度点突变检测的进一步应用，研究者提出了一种可行的检测策略：将ssDNA设为靶标并引入辅助链——辅助链与野生型ssDNA（WT）互补，并且在位置6或12处与突变型ssDNA（MT）单碱基错配。调整辅助链的序列和长度，并与MT或WT形成PAM⁻SE⁺⁵ dsDNA。然后采用 “双错配对单错配”策略，其中gRNA与WT形成两个错配，而与MT仅形成一个错配（图4A，B）。结果表明，该法DF增加到155-1411（中值207），并且低丰度靶向链的检测限达到低至0.0005%（图4C，D）。随后，研究者将该CRISPR-Cas12a系统应用于具有明确临床意义的六个点突变，结果表明（图4E，F，G）该CRISPR-Cas12a系统具有通用性和临床应用潜力。

图4. 引入辅助链增强低丰度点突变检测

由于常规扩增手段获得的产物都是平末端的dsDNA，为了能够方便地获得粘性末端的dsDNA，研究者们开发了一种技术手段，将扩增产物与10倍以上的辅助链混合后加热至95℃10 min，然后迅速置于冰上5 min（图5A），如此，由于0℃下的低动力学，原本的双链产物难以退火，但辅助链则可以凭借其高浓度而与靶标退火，从而获得具有粘性末端的dsDNA。在与另两种操作流程（图5B，C）的比较中，研究者们不仅进一步证实了0℃孵育对于整个反应的重要性，更是发现了CRISPR-Cas12a低温激活机制：CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性可以在0 °C下被MT/Helper双链体特异性激活并保持。当恢复到37 °C时，虽然辅助链可能被PCR产物的非靶向链置换，但荧光探针的切割已经开始，不会受到影响。利用建立起的该工作流程来检测质粒样品中具有临床意义的低丰度点突变，结果表明，对于六个测试的靶向突变，检测限为0.01-0.05%，证明了研究者建立的系统对基因组样品具有功能性。

图5. CRISPR-Cas12a的低温激活和低丰度点突变检测

为了进一步提高研究者建立的CRISPR-Cas12a系统的应用潜力，研究者测试了该系统与其它信号转导方法的兼容性，如基于AuNPs的荧光共振能量转移（FRET）系统。当CRISPR-Cas12a被靶向底物激活时，它会切割纳米颗粒表面的信号探针。研究者根据该原理合成AuNP-DNA探针（图6A），借助前文建立起的检测系统来区分合成链和质粒基因组DNA中的EGFR T790M单碱基错配并检测低丰度点突变，结果合成链的检测限为0.005%，质粒基因组DNA的检测限为0.01%（图6D，E），表明研究者提出的CRISPR-Cas12a系统与基于AuNPs的FRET系统相容，从而在进一步开发多重测定中显示出巨大的潜力。最后，研究者将该CRISPR-Cas12a系统应用于临床样本（卵巢癌相关的TP53 R248W和与肺癌相关的EGFR T790M突变），测试样品的突变丰度与NGS结果一致性良好，平均偏差仅为6.146%，表明其临床的实用性。

图6. 突变检测系统与FRET的兼容性及其临床应用

研究者发现了一种全新的CRISPR-Cas12a靶向底物（粘性末端dsDNA，PAM⁻SE⁺ dsDNA），基于这种底物，可以使CRISPR-Cas12a实现在不需要PAM序列的情况下识别和切割dsDNA的能力，以及对底物dsDNA内错配的超敏感性。基于该底物，CRISPR-Cas12a检测系统可兼具灵敏度、特异性和通用性等特点。研究者还发现CRISPR-Cas12a的低温激活特性，并通过将低温下独特的DNA杂交动力学与RPA或PCR扩增过程耦合，最终实现了对低丰度点突变的快速、方便、准确和灵敏检测。研究者的工作不仅大大加深了对CRISPR-Cas12a系统的理解，而且大大拓宽了其应用场景。

参考文献：

[1] Zhang W, Mu Y, Dong K, et al. PAM-independent ultra-specific activation of CRISPR-Cas12a via sticky-end dsDNA. Nucleic Acids Res. 2022 Dec 9;50(22):12674-12688. doi: 10.1093/nar/gkac1144.