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高灵敏与可视化CRISPR-Dx检测方法，对现场快检具有重要意义。有关这方面的研究有什么最新动态呢？随小编一起来看看今天的文章吧~
高灵敏与可视化检测方法创新对现场快检具有重要意义。近日，来自山东师范大学化学化工与材料科学学院的唐波教授团队利用纳米磁珠（MNP）-ssDNA-葡萄糖氧化酶（Gox）整合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a系统成功开发基于视觉可视化的核酸超敏检测技术体系，相关研究成果以“CRISPR-Cas12a-based ultrasensitive assay for visual detection of SARS-CoV-2 RNA”为题发表在分析化学领域知名期刊《Analyst》上。
在这项研究中，使用RPA或RT-RPA扩增靶标核酸，产生的DNA扩增子激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性。然后，激活的CRISPR-Cas12a降解MNP上的单链DNA，从MNP中释放的GOx催化显色底物，通过溶液中的视觉颜色变化实现对靶标的快速检测（图1）。
图1. 纳米探针偶联CRISPR-Dx系统的技术流程
文章首先详细介绍了MNP-ssDNA-Gox的合成与制备工艺，并对其性能进行表征和验证，在此基础上以SARS-CoV-2 N基因扩增产物为例验证该技术体系的可行性（图2）。作者首先合成了聚丙烯酸包被的磁性纳米颗粒（MNPs-PAA），并用链霉亲和素（SA）进行修饰；然后，合成了ssDNA修饰的GOx（GOx-ssDNA）；将GOx-ssDNA与MNPs-SA混合，制备了由ssDNA连接的GOx修饰MNPs（MNPs-GOx）。MNPs-GOx可以与无色底物发生反应，产生视觉颜色变化。经RPA试剂盒有效扩增靶标核酸后，荧光信号验证了扩增片段可激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性，随后用激活的CRISPR-Cas12a切割MNPs-GOx上的ssDNA，导致GOx从MNPs表面分离，反应获得的上清液与底物反应产生显著的颜色变化，将核酸信号成功地转导为颜色信号。
图2. 检测体系的可行性测试
接下来，研究团队从酶切孵育时间、Cas酶浓度、Mg2+浓度等方面对检测体系进行了优化（图3），并最终采用了50 nM CRISPR-Cas12a，30 mM Mg2+，反应20 min的优化条件开展后续实验。
进一步地，研究团队对该体系的LOD、线性区间、特异性等方面进行了研究和验证。结果表明该方法可检测低至10 aM（约6 copys/μL）的靶核酸，对应设备的LOD为2.86 aM（约2 copys/μL)，与PCR的灵敏度相当。作者随后提取不同种类病毒（MERS-CoV病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒）的基因片段，验证上述体系的检测特异性。结果显示，在检测干扰基因片段时，未见颜色变化。相比之下，目的基因片段可以被特异性扩增，然后引发显著的颜色变化。结果表明，该方法对特异性基因序列具有良好的检测特异性（图4）。
最后，研究团队还用该法对SARS-CoV-2真实基因序列进行了检测，并验证了该方法可在50 min内完成新冠病毒ORF1ab的检测。且超低浓度的SARS-CoV-2 RNA片段可以成功地诱发产生高稳定性的比色信号，该方法的检测重复性较好。因此，该技术体系在病原体现场检测领域具有广泛的应用潜力。
该研究提供了一种用于病毒核酸即时、超敏的可视化检测方案。RPA或RT-RPA可以高效扩增靶标核酸，进而激活CRISPR/Cas以降解ssDNA，从而释放GOx并随后产生比色信号。该方法操作简单，不依赖于昂贵的设备即可实现信号放大和可视化输出，特别适用于在护理点进行分子诊断，并有望应用于资源有限地区的传染病控制。
参考文献：
[1] Gong S, Song K, Pan W, Li N, Tang B. CRISPR-Cas12a-based ultrasensitive assay for visual detection of SARS-CoV-2 RNA. Analyst. 2024 Jul 16. doi: 10.1039/d4an00479e. Epub ahead of print. PMID: 39011640.
