吐 吐
露
心
声
CRISPR-Dx作为全新的下一代分子诊断技术， 已被广泛应用于核酸以及非核酸靶标的检测。为了提高CRISPR-Cas12a的灵敏度，可以采取优化sgRNA、结合预扩增、改造cas蛋白、级联放大等策略，但这些方法需要更长的反应时间和更复杂的设计。如何方便快速的提升检测性能呢？大家随小编一起来看看今天的文章吧~
近日，来自华中科技大学同济医学院药学院的吴曈勃团队系统地探究了底物长度和反应条件对反式切割活性的影响，与优化前的条件相比，Cas12a的活性提高了约50倍，研究论文“Unlocking the Full Potential of Cas12a: Exploring the Effects of Substrate and Reaction Conditions on Trans-Cleavage Activity”发表在 Analytical Chemistry期刊上。
作者选用dsDNA为激活剂，FAM荧光基团与BHQ淬灭基团修饰的ssDNA为报告探针。当报告探针长度从5 nt增加到30 nt时，Cas12a反式切割速率呈抛物线趋势，在15 nt时Cas12a的反式切割活性达到最大（图1 b）。不同菌株来源Cas12a（AsCas12a, LbCas12a），使用不同dsDNA底物（BRAF、EGFR和随机序列dsDNA），当报告探针长度变化时，均显示出相似的活性趋势，15 nt时活性均达到最大值。
据报道，Cas12a的反式切割活性可随机将ssDNA切割成2~4 nt的寡核苷酸片段。因此，在大多数研究中，为确保Cas12a只对报告基因进行一次切割，提高切割效率，增加荧光信号强度，常采用长度为5~7 nt的ssDNA报告探针。
作者接下来对15 nt报告探针可实现Cas12a反式切割最大活性的作用机制进行了解析。15 nt的ssDNA与带正电的结构域有非常好的结合（图1c粉色区域）。对于长度大于15 nt的ssDNA，虽然也可以结合到正电结构域，但相较15 nt的ssDNA，其多出的3’端更易被Cas12a进行多次切割，降低荧光增加率。对于小于15 nt的ssDNA，其长度不足与正电结构域结合，仅可通过扩散运动进入Cas12a的剪切活性位点（图1d）。
作者还测试了不同长度报告探针的3’末端缩短、巯基取代等对Cas12a的反式切割活性的影响。使用长报告探针时，报告探针沿3 '端缩短或巯基修饰对反应速率没有显著影响（图1e）。这表明能提高反应速率的报告探针长度存在一个阈值，同时表明Cas12a对单链底物的反式裂解活性不是“随机的”，而是专门从单链底物的一端进行切割，这在一定程度上证实了上述机制假设。对于较短的报告探针，3’端巯基修饰（7 nt-2S）不影响反应速率，但缩短底物长度（5 nt）导致反应速率显著降低。这进一步证实了机制假设。
作者首先优选了Cas12a与crRNA的比例以进一步优化Cas12a反式切割的反应条件。当Cas12a:crRNA达1:2时，Cas12a几乎完全被激活，当crRNA的浓度进一步增加时，反应速率只有微小的变化。而在ssDNA激活的Cas12a系统中，crRNA浓度的增加对反应速率几乎没有影响，这意味着1:1的Cas12a/crRNA比例适合于ssDNA激活的系统（如图2a）。
反应缓冲液对酶反应速率有显著影响。作者探究了实验室常用的8种缓冲液对反式切割活性的影响。结果表明，Cas12a在NEBuffer 4中具有最佳的反式剪切活性（图2b），比推荐的NEBuffer 2.1快了近5倍。作者比较了NEBuffer 2.1与NEBuffer 4的区别，发现NEBuffer 4含有钾离子（K+）和二硫苏糖醇（DTT）。当在NEBuffer 2.1中加入额外的K+时，无论是5 nt报告探针，还是15 nt报告探针，Cas12a的反应速率均显著提高（图2c，d）。推测K+可以促进短ssDNA（报告探针）进入Cas12a的活性切割位点。作者还研究了一些缓冲液中DTT浓度对反应速率的影响。随着DTT浓度的增加，反应速率显著降低，但在反应体系中用DTT取代牛血清白蛋白可显著提高Cas12a的反应活性。
作者测试了Cas12a对具有特殊结构或类型的报告探针的切割活性，如发夹结构报告探针、固定在金纳米颗粒上的报告探针等。
作者首先测试了发夹结构报告探针的环长度对Cas12a活性的影响。结果表明Cas12a对不同环长度的发夹报告探针的反应速率趋势为30 nt≥15 nt > 5 nt（图3b），且在优化的NEBuffer 4中使用15 nt环发夹报告探针时，反应速率仍然最高。带30 nt环的发夹报告探针，其环张力较小，其环性质与常规ssDNA性质相似，易与正电结构域结合并被多次剪切。由于30 nt环发夹报告探针的序列总长度比30 nt常规ssDNA长，Cas12a对其荧光增加速率比30 nt常规ssDNA稍慢（图3b）。对于15 nt环发夹报告探针，由于环张力，其不能像15 nt常规ssDNA那样与正电结构域相互作用，因此其反应速率要慢得多。当在缺乏K+的NEBuffer 2.1中，或者当发夹报告探针或常规ssDNA探针长度为5 nt时，Cas12a的正电结构域不能与报告探针结合。在这种情况下，由于茎环DNA对Cas12a具有高亲和力，因此首选发夹报告探针。
作者在金纳米颗粒上固定了不同长度的ssDNA报告子，结果显示，当金纳米颗粒上的报告探针长度为40 nt时，反应速率达到最大（图3d），这可能是由于AuNPs与酶之间的表面相互作用影响，如吸附力、静电排斥、位阻等。同组测试了不与金纳米颗粒结合的5 nt和15 nt游离ssDNA报告探针对照，结果显示，游离15 nt ssDNA报告探针呈现最高的反应速率。
最后，作者对比了4种组合方式的LOD：
a）15 nt 常规ssDNA报告探针 + NEBuffer 4
b）15 nt 常规ssDNA报告探针 + NEBuffer 2.1
c）5 nt 常规ssDNA报告探针 + NEBuffer 4
d）5 nt 常规ssDNA报告探针 + NEBuffer 2.1
上述四种组合的LOD分别为0.12 pM，0.85 pM，9 pM，170 pM（图4）。结果表明，使用合适的底物和缓冲液可以将Cas12a的检测限提高约1417倍。
图4. Cas12a检测限比较
参考文献：
[1] Xu J, Liu Z, Zhang Z, Wu T. Unlocking the Full Potential of Cas12a: Exploring the Effects of Substrate and Reaction Conditions on Trans-Cleavage Activity. Anal Chem. 2023 Jul 18;95(28):10664-10669. doi: 10.1021/acs.analchem.3c01307. Epub 2023 Jul 1. PMID: 37392174.
