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检测miRNA的表达丰度，对癌症等疾病的诊断和治疗具有重要的意义。那么，如何利用CRISPR技术实现miRNA的免扩增检测呢？大家带着这个问题，随小编一起来看一下研究者们开发出了怎样的CRISPR检测新方法来实现临床癌症样本中miRNA的免扩增检测吧~
基于CRISPR技术的核酸检测为分子诊断提供了一种快速、灵敏、简便的解决方案，但实际应用仍然面临一些挑战，比如需要预扩增和较难定量等。今天跟大家分享一篇题为“Asymmetric CRISPR enabling cascade signal amplification for nucleic acid detection bycompetitive crRNA”的文章，来自康涅狄格大学研究团队。在这篇研究工作中，作者开发了一种非对称CRISPR（asymmetric CRISPR）检测方法，利用竞争性crRNA的非对称反式剪切进行待测核酸的级联信号放大。从而不需要进行预扩增，就能定量检测microRNA，且灵敏度达到了856 aM。此外，作者用该方案检测了膀胱癌患者血浆样本中的miR-19a生物标志物，证明该检测方案具有广泛的应用潜力[1]。
之前有文献提出了CRISPR/Cas12a的活性重置机制，即在Cas12a被特异靶标激活后，新的crRNA可以通过R-loop替代，重置Cas12a 的特异性，靶向新的DNA。当新的DNA不存在时，其反式剪切活性关闭[2]。因此，作者假设，当Cas12a的活性被full-sized crRNA激活以后，split crRNA可以取代full-sized crRNA和Cas12a结合，从而起到信号放大的作用。为了验证这个假设，作者设计了竞争实验（图3c），split crRNA与crRNA的结合在无靶标或非特异靶标（non-target）存在的情况下被full-sized crRNA抑制；但当特异靶标full-T存在时，full-sized crRNA/Cas12a被激活，然后split crRNA可以通过R-loop取代full-sized crRNA-DNA，从而结合到Cas12a。因此作者利用这个原理建立了非对称CRISPR检测方案，即利用split crRNA的取代实现级联信号放大。
接下来，作者用常规CRISPR法和非对称CRISPR法分别检测不同浓度下靶DNA的荧光信号，结果表明，非对称CRISPR检测以100 fM的检测限(LOD)检测出ssDNA靶点，灵敏度是常规CRISPR/Cas12a检测法的100倍（图4）。因此，可以利用非对称CRISPR实现对核酸靶标的高灵敏度检测。
作者首先利用该体系实现了对RNA的检测。通过使用两个片段化的核酸靶标，作者发现：当两段都为DNA序列时，它们能特异性结合crRNA的spacer区并激活较高的Cas12a反式剪切活性；当与crRNA spacer区5'端结合的序列为DNA，3'端结合的序列为RNA时，也会激活反式剪切，但是活性有降低；相反，当与crRNA spacer区5'端结合的序列为RNA，3'端结合的序列为DNA时，不能激活Cas12a的反式剪切（图5）。该现象可能是因为DNA靶标与crRNA种子区的结合亲和力更高。已有文献报道在Cas12a的原间隔区，距离PAM 5-10个核苷酸( nt )的种子区域（seed region）对于Cas12a的靶标识别非常重要。此外，也有类似报道，crRNA的PAM -近端种子区域严格需要DNA启动反式剪切，而PAM -远端区域或crRNA spacer的3 '端可以同时耐受DNA或RNA底物。因此，作者在本研究中也采用片段化的RNA/DNA靶标策略启动Cas12a的反式剪切活性，实现RNA靶标检测。
接下来，作者尝试将非对称CRISPR应用于miRNA的检测。选择miR-19a作为靶标miRNA ，因为它是许多癌症早期诊断的潜在生物标志物。作者设计了一个通用的ssDNA activator，与crRNA的种子区互补；同时能够识别ssDNA activator和miRNA靶标的crRNA简称为RD crRNA。结果表明，RD crRNA与ssDNA activator的结合长度与Cas12a的反式剪切活性高度相关，随着结合长度减少到10 nt以下时，反式剪切活性急剧下降（图6）。
接下来，作者验证了非对称CRISPR用于免扩增检测miRNA的可能性。在体系构建中，作者设计了一段full-sized crRNA和一段split crRNA，full-sized crRNA可以识别DNA activator和miRNA，并介导Cas12a反式激活；为了不需要添加额外split crRNA对应的 target，作者使DNA activator同时可以被split crRNA识别，从而构建出一个非对称CRISPR cascade检测体系（图7a）。然后，作者对反应条件（两种crRNA浓度，Cas12a浓度以及DNA activator浓度和反应时间）进行了优化。在优化后的反应条件下，作者监测了不同浓度miRNA的( 1 fM到1 nM )实时荧光信号：在高浓度靶标miRNA条件下( ≧100 pM )，非对称CRISPR与常规CRISPR检测相比无显著差异；然而，在低浓度靶标条件下( 1 fM-10 pM )，两种检测方案的荧光信号出现了明显的差异(图7g)，充分体现出非对称CRISPR中利用split crRNA实现的信号级联放大的优势。
最后，作者探讨了非对称CRISPR检测在miRNA液体活检和癌症诊断中的应用潜力，以膀胱癌患者血浆样本中miR-19a为待测靶标，使用非对称CRISPR分析了其表达水平（图8）。结果证实miR-19a在膀胱癌患者样本中的总体表达水平高于健康供者样本。作者开发的检测方法与RT - qPCR的结果具有良好的一致性。
参考文献：
[1] Moon, J. and C. Liu, Asymmetric CRISPR enabling cascade signal amplification for nucleic acid detection by competitive crRNA. Nature Communications, 2023. 14(1): p. 7504.
[2] Stella, S., et al., Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity. Cell, 2018. 175(7): p. 1856-1871.e21.
