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核酸检测金标准PCR具有较高的检测灵敏度，NGS实现了高通量，但它们均依赖于复杂仪器和专业的人员……CRISPR-Dx作为全新的下一代分子诊断技术，要解决的正是简便和快速，以满足即时、现场的检测需求。未来，甚至田间地头的农民、畜牧养殖厂的一线工作人员均可以操作，颠覆核酸检测传统，更有利于病原的有效控制，助力农业、畜牧业、宠物和人类健康！
crRNA的设计在基于CRISPR/Cas12的靶向检测体系中发挥了重要作用。因此，作者首先针对ASFV的多聚蛋白pp220编码基因、DNA聚合酶编码基因（DNA Pol）的保守区域设计了6条crRNA。为了检测不同crRNA的靶向效率，作者分别在Cas12a顺式剪切体系（图1）和反式剪切体系（图2）中检测了各条crRNA的表现。当DNA Pol或pp220 dsDNA靶标序列出现时，crRNA1靶向的DNA Pol和crRNA5靶向的pp220在剪切效率上优于其他crRNA。因此，作者选择以DNA Pol为靶点的crRNA1和靶向pp220的crRNA5进行体系搭建。
为了确定基于CRISPR/Cas12a检测体系的特异性，作者引入了一系列的双核苷酸突变。结果表明，在DNA Pol或pp220 dsDNA的靶向体系中，PAM和PAM近端的突变几乎使荧光信号降低到本底水平，而PAM-远端17-20 nt出现的突变仍会产生部分的荧光信号（图3），证明基于CRISPR/Cas12a的ASFV序列检测具有较高的特异性。
图3.LbCas12a检测体系的序列特异性
为了进一步确定CRISPR/Cas12a检测体系对ASFV的特异性，作者引入了常见猪病原体，包括伪狂犬病毒（PRV）、猪环状病毒（PCV）、猪链球菌（SS）、猪鼻支原体（MH）和副猪嗜血杆菌（HPS）等，并提取其基因组DNA进行检测。DNA pol crRNA1和pp220 crRNA5均表现出较高的针对ASFV的特定荧光信号，而对上述其它病原体无非特异信号（图4）。
图4.LbCas12a检测体系对ASFV的特异性
为了探索该检测方案的实际样本检测性能，作者从ASFV感染猪的血液和肛门拭子中提取DNA。通过PCR富集靶标，在Cas12a/crRNA复合物和ssDNA-FQ报告探针存在的情况下，所有阳性样本，包括血液样本5例（血液样本1-5）和拭子样本1例（拭子样本1），使用crRNA1或crRNA5均显示出强烈的荧光信号；所有阴性样本，包括血液样本3例（血液样本6-8）和拭子样本2例（拭子样本2-3）的荧光信号与NC比没有差异。以上结果表明，基于CRISPR/Cas12a可对ASFV实际样本进行较高精度的检测（图5）。
图5. LbCas12a检测带有ASFV病毒的实际样本
原始的基于荧光qPCR检测ASFV的一个最大缺点是需要特殊的实验室设备和专业人员，这是畜牧业和农业一线工作者难以获得的。鉴于ASFV的高传染性和快速传播的特性，开发一种能够监测现场ASFV病毒并能由非专业人员操作的实时检测方法至关重要。因此，作者结合RPA恒温扩增，CRISPR/Cas12a检测体系和试纸条读取，建立了能满足了现场检测需求的方案。试纸条的读取原理如下图（图6）：与anti-FITC/FAM抗体结合的金纳米颗粒包埋在结合垫上，C线包被链霉亲和素，T线包被IgG二抗；双端分别标记FAM（或FITC）和Biotin的ssDNA报告探针替代原本Cas12a/crRNA反式剪切体系中的FQ荧光探针。（备注：FAM或FITC端用于结合anti-FITC/FAM的金纳米颗粒，因此两种标记二选一即可，可以采用FAM-Biotin-ssDNA探针或FITC-Biotin-ssDNA探针）。以FAM-Biotin-ssDNA探针为例，当探针未被Cas12a降解时，完整的探针与链霉亲和素结合，被捕获在C线上，FAM端结合anti-FITC/FAM标记的金纳米颗粒，导致仅C线显色，指示结果为阴性。当Cas12a/crRNA识别到靶标并被反式激活时，会剪切FAM-Biotin-ssDNA探针，因此FAM端碎片可以越过C线，FAM端结合的anti-FITC/FAM标记的金纳米颗粒被T线处的二抗IgG捕获，导致T线显色，指示结果为阳性。
图6. CRISPR/Cas12系统试纸条
当作者应用试纸条检测时，在无FAM-Biotin-ssDNA探针的空白对照中显示了一个明显的假阳性条带（图7a）。这是因为一部分纳米颗粒随着液体流动不断地前进，直接到达T线，从而产生假阳性结果，FAM-Biotin-ssDNA探针浓度提高可减少假阳性条带（图7a）。因此，在基于CRISPR的试纸条检测中，合适浓度的FAM-Biotin-ssDNA探针是必须的。在后续研究中，作者选择了1 μM FAM-Biotin-ssDNA探针浓度。为了明确Cas12a试纸条检测的最佳反应时间和温度，作者比较了反应时间1、2、5、10 min，反应温度4°C，室温37°C。结果表明，2 min的反应时间足以观察到清晰的测试带，且室温下的反应带比4°C和37°C下的反应带更清晰。在以上优化条件下，试纸条检测ASFV的灵敏度可以达到2×102 copies（图7b）；该方案的检测结果与传统qPCR具有一致性（图7c），且具有针对ASFV靶向检测的特异性（图7d）。
图7. LbCas12a结合试纸条检测的灵敏度和特异性
该检测方法的灵敏度低至200个拷贝/样本，可适用于现场分析，检测方法灵敏准确（图8），该条带可在4°C的干燥环境中保存至少3个月。
图8. LbCas12a结合试纸条检测的工作流程
参考文献：
[1].Lu S, Li F, Chen Q, Wu J, Duan J, Lei X, Zhang Y, Zhao D, Bu Z, Yin H. Rapid detection of African swine fever virus using Cas12a-based portable paper diagnostics. Cell Discov. 2020 Apr 7;6:18. doi: 10.1038/s41421-020-0151-5. PMID: 32284877; PMCID: PMC7136273.
