2020年的时候，Cameron Myhrvold还在Broad研究所做博后的时候，和导师Pardis Sabeti教授一同开发了CARMEN技术。2年后，又再次与Sabeti教授一起将CARMEN与microfluidic微流控技术结合，开发了mCARMEN，让CRISPR超多重检测更加便捷更加可行，工作也于2022年发表在Nature Medicine上。目前，Cameron Myhrvold博士已经是普林斯顿大学的助理教授了，并组建了自己团队，专注于CRISPR技术来研究病毒和宿主RNA，包括检测和破坏病毒RNA。这篇工作中，Myhrvold教授也是最后的通讯作者，所以，做CRISPR诊断还是容易出成果的；当然，前提是得像Myhrvold教授这样优秀才行。
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作者首先比较了mCARMEN和CARMEN的实验过程，证明了mCARMEN更简便，更快捷。![]()
接着证明了mCARMEN有很高的特异性和灵敏度，与CARMEN相比，有很高的一致性，但是检出率和反应效率更高一些。
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并且，使用临床样本测试时，mCARMEN跟临床诊断结果完全一致，与NGS结果也有很高的一致性。![]()
接着，作者开发了mCARMEN自动化工作站，从拭子样本出发，到RNA自动化提取，到RT-PCR，再到Cas13反式切割，最后是结果分析，整个流程控制在4h左右。并且跟RT-qPCR相比，mCARMEN有更高的检出率，要看b图上面的那个同步测试的实验结果，相同的样本状态才具可比性。![]()
这里，作者把Cas13和Cas12联用，用Cas12检测高浓度靶标，而用Cas13检测低浓度靶标。对于Cas13来说，因为PCR的扩增产物需要再经过一次体外转录，又有一次模板放大的作用，所以，放大的倍数太高，不太适合高浓度模板（稍高浓度的模板都会得到饱和的信号，没法区分），相反比较适合低浓度模板（即检测的灵敏度比较高）。将两种方法联用后，mCARMEN的定量检测范围更广了。后面还有两张图，是用mCARMEN的高特异性（可以区分单碱基差异）来区分新冠的不同毒株，并且做了些分子流行病学的工作，不再详细阐述。这篇工作是在前期CARMEN的基础上，引入了微流控技术和Cas13/12双酶体系，获得了更便捷且定量范围更广的mCARMEN技术。1. Myhrvold博士师从Sabeti教授后做了很多CRISPR诊断的工作，除了CARMEN外，其实还有早期的HUDSON-CRISPR诊断方法，也是发表在Science杂志上。但是，HUDSON那篇工作实际上没啥意思。
2. mCARMEN的检测要4h左右，速度不算快，但是考虑其检测通量来说，这个速度也还能接受。
3. CRISPR诊断其实也是一个定量技术。从这篇工作的Figure 4c来看，不管是SARS-CoV-2还是FLUAV靶标，Cas12的定量效果和RT-qPCR相当，而且还稍好一些；Cas13的定量效果稍差，不过这时候的模板浓度已经很低了，对应的RT-qPCR的Ct值已经超过40了，基本都判阴了。另一个Cas13定量稍差的可能原因是因为检测流程需要两步放大，扩增+转录，这些可能也是个影响因素。4. 这里用Cas12和Cas13联用来提高mCARMEN的定量检测范围，也是一个有点令人意外的想法。原本还以为将两个方法联用来做内参，不过，这里的使用方式倒也蛮有意思。
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参考文献：
[1] Welch NL, Zhu M, Hua C, Weller J, Mirhashemi ME, Nguyen TG, Mantena S, Bauer MR, Shaw BM, Ackerman CM, Thakku SG, Tse MW, Kehe J, Uwera MM, Eversley JS, Bielwaski DA, McGrath G, Braidt J, Johnson J, Cerrato F, Moreno GK, Krasilnikova LA, Petros BA, Gionet GL, King E, Huard RC, Jalbert SK, Cleary ML, Fitzgerald NA, Gabriel SB, Gallagher GR, Smole SC, Madoff LC, Brown CM, Keller MW, Wilson MM, Kirby MK, Barnes JR, Park DJ, Siddle KJ, Happi CT, Hung DT, Springer M, MacInnis BL, Lemieux JE, Rosenberg E, Branda JA, Blainey PC, Sabeti PC, Myhrvold C. Multiplexed CRISPR-based microfluidic platform for clinical testing of respiratory viruses and identification of SARS-CoV-2 variants. Nat Med. 2022 May;28(5):1083-1094. doi: 10.1038/s41591-022-01734-1. Epub 2022 Feb 7. Erratum in: Nat Med. 2024 Jan;30(1):307. doi: 10.1038/s41591-023-02684-y. PMID: 35130561; PMCID: PMC9117129.
