TOLO智库 | CRISPR核酸多重检测新思路：增强水凝胶微粒与CRISPR技术的碰撞

核酸（NA）是疾病筛查与监测的重要生物标志物，CRISPR技术的问世，为核酸检测提供了一系列强大的工具库。尤其是在Cas12a等效应蛋白中非特异性反式切割机制的发现，使得CRISPR系统能够实现对单核苷酸突变的信号放大与精确检测。迄今，CRISPR/Cas系统已经在病原体、癌细胞等多领域应用中显示出了高灵敏度、高特异性等强大的优势。但高通量及多重核酸检测等，仍是CRIPSPR/Cas生物传感系统应用中需要深入研究的课题。一锅、多重核酸检测，仍存在较大的挑战。通过筛选并正交不同Cas效应蛋白能一定程度上解决这一问题，但正交Cas效应蛋白策略最多可实现四个靶标的多重检测。通过空间划分不同Cas反应，并进行平行分析是一个较为可行的策略。微流体可以满足这种反应划分及平行分析的需求，可实现高通量的核酸检测。然而微液滴法属于过程密集型技术，需要复杂的仪器进行单个液滴的生成、合并、检测等过程。而水凝胶微粒（HMPs）可以作为较理想的CRISPR/Cas分区反应容器，实现反应划分、平行分析及微流控过程简化等。那么，偶联水凝胶材料、微流控及CRISPR-Cas技术，在核酸多重检测应用中能擦出什么样的火花呢？

本文作者在“CRISPR-Enhanced Hydrogel Microparticles for Multiplexed Detection of Nucleic Acids”一文中报道了基于HMP及CRISPR/Cas系统的多重NA靶标检测平台CLAMP（Cas-Loaded Annotated Micro-Particles）。研究团队将Cas蛋白固定在空间编码的HMPs中，将每个HMP变成一个离散的NA检测的容器。每一种标记有空间编码的HMP，可识别一个单独的NA靶标；在识别NA靶标后，Cas12a/gRNA复合物切割荧光标记探针，并启动HMPs内的荧光信号。作者设计了一个微流控装置进行信号检测，建立了一个基于计算机编程识别的算法来识别HMP类型并量化其荧光强度。CLAMP检测平台成功应用于临床样本中高危型人乳头瘤病毒（HPV）检测。

作者首先制备了针对不同NA靶标的HMPs。作者通过掩模光刻技术制作了HMPs模式物（图1a）。将含有丙烯酸、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和光引发剂的预聚物溶液通过光掩膜暴露在紫外线下，将溶液光固化成刻有识别码的圆盘状粒子。Cas12a蛋白通过碳二亚胺化学过程与HMPs中的羧酸基偶联。该固定化步骤可维持HMPs内的高Cas12a浓度并防止粒子间的串扰。随后作者将Cas12a-HMPs与gRNA孵育，使粒子（Cas12a/gRNA-HMPs）具备识别靶NAs的能力。作者还制备了F-Q报告基因探针（单链DNA的两端分别结合一个荧光基团和一个猝灭基团）。该探针在被激活的Cas12a/gRNA复合物切割时产生荧光信号（图1b）。

为了确定Cas12a-HMP制备的最佳条件，作者探究了Cas12a的浓度及其与HMPs的偶联时间。然后用制备的Cas12a-HMPs检测合成的NA靶标。NAs和荧光报告基因都扩散到HMPs中，与Cas12a/gRNA复合物发生反应。当使用在较高的Cas12a浓度下制备的Cas12-HMPs时，CLAMP荧光信号更高（图1c），但蛋白聚集超过了最大值。Cas12a与HMPs偶联的最佳反应时间约为2 h。

作者进一步对HMPs中的Cas12a蛋白进行表征。作者通过将Cas12a-HMPs与荧光基团标记的gRNA孵育来评估蛋白量（图1d），并将得到的HMP荧光信号关联gRNA校准曲线。假设gRNA与Cas12a以1：1的速度结合，结果表明，每个HMP约有5.2 fmol的Cas12a被固定化（或4.9 μM/HMP）。作者通过靶NAs孵育粒子来激活HMPs中的Cas12a/gRNA复合物。然后将激活的Cas12a-HMPs与F-Q报告基因探针混合，并监测荧光信号。图1e显示了不同探针浓度下的初始切割速率。

基于使用Cas12/gRNA-HMPs，作者建立了整体CLAMP检测方案。作者优化了Cas12/gRNA-HMPs和NAs靶标的反应时间（图2a），探针浓度（图2b），结果显示，反应1 h，分析信号开始趋于稳定，2 μM报告探针可使信噪比最大化。在单个HMPs中包含DNA探针，对保持高灵敏度和最小化粒子间的串扰也至关重要，作者通过将HMPs浸在不混溶油中来实现这一过程。优化的CLAMP可实现分析检测限低至3 pM，检测范围跨越两个数量级。最后，作者进一步验证了，只有当所有检测成分都存在时，才会产生阳性信号（图2d）。

作者设计了NA多重检测系统。为了区分靶标特异性的HMPs，作者用由三个点和一个L形指示器组成的空间编码来印记粒子（图3a）。研究团队设计了一个微流控芯片来放置独立的HMP粒子（图3b）。该芯片包含一系列HMP捕获结构。制备的芯片具有> 90%的捕获效率。重要的是，它阻止了粒子间的相互作用，简化了与油的缓冲交换，并加速了HMP成像。 

作者采用了一种ML的方法来自动分析HMP粒子。作者选择Mask R-CNN作为ML引擎，用不同HMP的明场像训练Mask R-CNN模型。训练后的模型实现了4种不同的HMP类型的区分（图3e），并在单独的验证中获得了较高的准确率（0.979）和F1评分（0.978）。经过HMP识别，可将空间编码空间划分转化成荧光图像，并读取每个粒子的荧光强度。

为了探索CLAMP在临床应用中的潜力，作者将其应用于高危型HPV（HPV16，HPV18）多重检测。GAPDH靶标作为细胞阳性对照。作者首先为每个靶标设计了一组gRNAs，并比较了它们在无靶标时的特异性，最终选择了一锅法多重NA检测的gRNA库（图4a）。作者还增加了上游NA扩增步骤，以提高检测灵敏度。作者采用等温重组酶聚合酶扩增（RPA）方法进行扩增。通过引入RPA，CLAMP可以将检测限降低到2 aM（图4b）。相比之下， 单独使用RPA的检测限约为145 aM，而使用常规qPCR的检测限约为10 aM。

作者进一步将CLAMP应用于单碱基错配区分。野生型配对的HPV16 DNA和一组在不同位置的单碱基错配的HPV16 DNA作为检测靶标。结果表明，CLAMP可实现对种子区域内距PAM序列约8 bp位置的单碱基错配区分。

接下来，作者应用CLAMP法检测宫颈癌细胞中的HPV DNA。作者从细胞裂解液中提取基因组DNA（gDNA），通过RPA扩增NA靶点，并进行CLAMP实验（图4c）。为了实现多重检测，作者为每个编码的HMP类型配置了不同的靶标识别功能（图4d）。CaSki（HPV16⁺）最低检测限约为10个细胞/mL（图4e)。作者进一步将多重CLAMP扩展到一组宫颈癌细胞系的检测中。CLAMP检测结果与已知的HPV16和HPV基因型细胞相匹配（图4f）。

图4. CLAMP多重检测人乳头瘤病毒

作者应用CLAMP法检测临床样本（子宫颈刷取物）中的HPV靶标。作者提取每个样本的gDNA，扩增NA靶标（HPV16、HPV18、GAPDH），并进行多重CLAMP检测。结果如图5a所示，在HPV阳性和阴性样本之间未观察到统计学差异。CLAMP检测结果与传统的HPV病理诊断结果一致。作者将标记阳性的阈值设置为3•𝜎，其中𝜎为空白样本的标准差。所有标记阳性样本的信号都高于阈值，而标记阴性样本的信号都低于阈值（图5b）。CLAMP的检测结果与qPCR的结果保持一致（图5c），显示了CLAMP的定量检测能力。

图5. HPV临床样本检测

作者设计了一种水凝胶微粒（HMPs）偶联CRISPR/Cas的多重NA检测平台CLAMP（Cas-Loaded Annotated Micro-Particles），该平台将CRISPR/Cas反应划分在空间编码的HMPs中，通过简化设计的HMPs粒子空间排列微流控芯片装置进行信号检测，并建立了一个基于计算机编程识别的算法来识别不同类型的HMP并量化其荧光强度。CLAMP成功应用于临床样本中高危人乳头瘤病毒（HPV）DNA靶标多重检测，能进行单碱基错配区分，并具备定量检测能力。CLAMP平台因其快速、高灵敏度（aM级检测限），一锅多重检测等优势，在临床人乳头瘤病毒检测中显示出巨大的应用潜力，有望实现基于智能手机读取的等温便捷检测。

参考文献：

[1] Roh YH, Lee CY, Lee S, Kim H, Ly A, Castro CM, Cheon J, Lee JH, Lee H. CRISPR-Enhanced Hydrogel Microparticles for Multiplexed Detection of Nucleic Acids. Adv Sci (Weinh). 2023 Apr;10(10):e2206872. doi: 10.1002/advs.202206872.