TOLO智库 | “PUMA”：Cas12系统直接检测RNA

本期分享的文献是来自德国维尔茨堡大学Rachael Larose1 & Chase L. Beisel研究团队，文章题目为“TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases”，于2024年7月发表在Nature Communications杂志上。在题述研究中，技术团队提出并系统验证了一种基于CRISPR/Cas12b识别RNA靶标的新机制。在CRISPR/Cas系统中，很多都需要用到tracrRNAs （trans-activating CRISPR RNAs）来产生guide RNA（gRNA）。已有证据表明，Cas9系统的tracrRNAs能够通过重编码将任何靶RNA转化为gRNA，将RNA的存在与Cas9介导的双链DNA切割联系起来。受此启发，作者通过重编码Cas12b核酸酶的tracrRNAs，将靶标RNA的存在与dsDNA顺式切割及随后对ssDNA的反式切割联系起来，检测序列不受PAM位点的限制。这种基于Cas12的RNA检测技术，即PUMA（Programmable Cas12 tracrRNAs Unlock PAM-independent detection of RNA）。PUMA检测体系的建立不仅将tracrRNAs的重编码技术引入到其他靶向dsDNA的Cas12核酸酶，而且显示出Cas12在RNA检测方面的潜在应用价值。

在Cas12 PUMA RNA检测系统中，待测RNA靶点不再像DETECTR系统中那样需要依赖PAM位点，而是将PAM位点人为附加到dsDNA上。在PUMA系统中, 重编码的tracrRNA（Rptrs）通过与待测RNA结合，将其转化为gRNA, 进而引导Cas12对dsDNA的识别切割，激活其反式切割活性，对荧光基团标记的ssDNA进行切割，并通过检测荧光信号来判定待测样本中是否存在阳性靶标（图1a）。理论上，阳性样本的荧光信号相较于阴性样本将显著增强。作者巧妙的利用了tracrRNA于gRNA之间的合成关系。通过Rptrs将RNA检测转化为了类似于CRISPR/Cas12 dsDNA的检测方式，为基于CRISPR/Cas12系统的RNA检测提供了新的思路。

如图1b-1c所示，在已知的14种Cas12的亚型中，有8种需要依赖tracrRNA来进行gRNA的合成，包括（Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f1, Cas12g, Cas12k and Cas12l）。并且，tracrRNA与crRNA的结合主要有5种形式。这类由tracrRNA和crRNA之间形成的RNA双链复合体的多样性和复杂性， 为通过Rptrs来构建Cas12 RNA检测体系奠定了坚实的理论基础。 

Bacillus hisashii Cas12b（BhCas12b）的tracrRNA-crRNA二聚体结构相对简单，其crRNA包含一个30 bp的长重复/反重复（LR/AR）区，在LR/AR与介导区域之间存在一个只有5 bp的短重复/反重复（SR/AR）区。tracrRNA与其结合于LR/AR及SR/AR区（图2a）。作者选用BhCas12b构建Cas12b PUMA检测系统。通过重编码形成不同的tracrRNA-crRNA二聚体，利用无细胞转录-翻译（TXTL）实验检测不同编码的检测效率，结果显示，无论是移除LR/AR区域的凸起的序列，亦或是重新编码LR/AR或SR/AR其他位点，均不影响Cas12b对dsDNA的识别（图2b-2c）。在此基础上，作者根据CJ8421_04975 mRNA序列信息，设计了两条Rptrs用于检测。结果显示，二者均能够成功检出目的RNA靶标，并且Rptrs/mRNA显示出与crRNA/tracrRNA配对相类似的结果。dsDNA的靶向特异性由引导序列的特异性来实现，种子区突变或tracrRNA的抗重复区（长，短，或长+短）的扰乱会使Cas12b 对dsDNA的识别功能丧失（图2d-2e）。总之，通过对Cas12b tracrRNA进行重编码能够将感兴趣的RNA与序列特异性的dsDNA联系在一起。

利用相类似的研究方法，作者又验证了此种方法在Cas12e及Cas12f1核酸中应用。结果表明，该体系也可拓展到具有不同TracrRNA-crRNA结构的不同Cas12核酸酶系统中。

如图4a所示，Cas12b PUMA检测体系的主要组分包括sensed RNA，Rptrs，Cas12核酸酶，包含PAM位点的dsDNA以及荧光基团标记的ssDNA。当sensed RNA与Rptrs结合后，将引导Cas12核酸酶识别并切割dsDNA靶标，激活反式切割活性，切割ssDNA，释放荧光信号，进而实现对RNA的检测。通常，只有Cas12b完成了对靶标dsDNA的切割后才能激活其反式切割活性。因此，Cas12b对dsDNA靶标链的切割效率对于系统的检出效率至关重要。鉴于此，作者通过优化dsDNA靶标链和非靶标链的长度来确定最佳的组合。结果显示，当靶标链缩短2 nt，非靶标链缩短6 nt，BhCas12b的反式切割活性最强（TS-2/NTS-6，图4b）。利用优化后的dsDNA，该系统对RNA检测的LOD达到1 μM（图4c）。利用同样的方法，作者又确定了适合DpbCas12e核酸酶的最佳dsDNA长度配比（TS-4/NTS-6）并测试了其LOD（图4d-4e）。综上，通过优化靶标dsDNA靶标链和非靶标链的长度比例，能够增强Cas12 PUMA系统RNA的检出效率。

有研究发现，Cas12-gRNA复合体在无靶标的情况也会产生持续性的荧光信号，严重影响系统的检出效率。在本研究中，研究团队比较了sgRNA与Rptr在无靶标存在情况下的Cas12检测系统的荧光值。如图5a-5b所示，在无sensed dsDNA存在的情况下，Cas12-gRNA系统均出现一定强度的荧光值，特别是BhsgRNA1。而在PUMA系统中，4条BHRptr反应均未发现明显的荧光信号。接下来，研究团队分别检测了BhsgRNA1与BhsgRNA1，及BHRptr1与BHRptr4在反应2 h及16 h的LOD（图5c-5d），结果显示，Cas12 PUMA系统用于RNA的灵敏度优于sgRNA引导的DNA检测。

图5. Cas12 PUMA RNA检测系统灵敏度优于sgRNA介导的DNA检测 

作者根据5种病原菌16 S rRNA的保守区域设计了通用的Cas12 Rptrs。Cas12 Rptr的一个核心特征就是与靶标RNA的碱基配对是灵活的，而靶向dsDNA的旁侧介导序列对错配是高度敏感的。根据这个特点，能与通用Rptrs相结合的靶标RNA即与16 S rRNA相对应，而根据不同种属可变区域合成的dsDNA只有与之完全配对才能被Cas12识别切割。因此，通过这个方式就能实现对病原菌的区分。作者首先比对了三种Cas12b蛋白（BthCas12b, BhCas12b 和AacCas12b）的特异性及对错配的敏感程度，通过使用包含两个连续错配碱基的Rptrs验证不同Cas12b蛋白对错配的敏感性。相较于BhCas12b 和AacCas12b，BthCas12b对错配表现出更高的敏感性，尤其是在近PAM位点的5-12 bp区（图6a）。在此基础上，作者设计了能够与5种病原菌16 S rRNA保守区域相结合的通用BthCas12b Rptrs，其下游可变区作为引导序列，用于区分病原菌（图6b）。只有能够与Rptrs-16 S rRNA guide区域完全配对的dsDNA, 才会激活Cas12b的反式切割活性，诱导产生荧光信号。结果显示，5种病原菌都能够被特异性的检出。值得注意的是，在L.m. 16S rRNA的检测体系中，S. aureus对应的dsDNA也产生阳性信号，这可能是二者序列的高度同源性造成的，二者引导区域仅有三个碱基不同，且不连续（图6c）。综上，仅需要一个Rptr就能实现基于16 S rRNA的病原菌特异性检测。 

图6. Cas12 Rptr在病原菌鉴定中的应用

参考文献：

[1] Jiao, C., Peeck, N.L., Yu, J. et al. TracrRNA reprogramming enables direct PAM-independent detection of RNA with diverse DNA-targeting Cas12 nucleases. Nat Commun 15, 5909 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-50243-x