吐
露
心
声
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，其传播途径包括血液、性接触、母婴传播等。乙肝病毒的普遍性和其对健康的潜在威胁，突显了早期诊断和及时治疗的重要性。那么乙型肝炎病毒有什么快速检测的好办法呢？今天，跟随小编的脚步，一起来看看利用CRISPR技术怎样快速检测乙肝病毒吧~
该方案的检测流程如图1A所示，首先采集HBV患者的血浆；经过样品处理后提取DNA；对HBV部分序列进行RAA扩增；T7转录获得靶单链RNA；CRISPR/Cas13a检测。经过序列比较，作者选择了保守的目标HBV序列(约200 bp)，并基于该序列构建了5个crRNA和3对RAA引物(图1B)。琼脂糖凝胶电泳分析结果显示，引物F2/R4的扩增效率较高，可用于进一步的研究(图1C)。Cas13a/crRNA荧光检测结果显示，crRNA3产生的终点荧光值较高(图1D)。因此，作者采用引物F2/R4和crRNA3建立了HBV DNA检测体系。
为了评估该检测体系的性能，作者进行了LoD、特异性和可重复性测试。首先，作者使用103拷贝/μL的HBV、HCV、HDV、HEV、HIV质粒分别作为Cas13a/crRNA检测模板，并比较了HBV与其他临床常见病毒(HIV、HCV、HDV和HEV)的保守区序列的一致性。结果显示该Cas13a/crRNA系统对HBV有较高的选择性，检测特异性为100%(图2A,B)。紧接着，作者通过梯度稀释的HBV质粒(100~104拷贝/μL)用于Cas13a/crRNA检测，结果LoD为10拷贝/μL(图2C)。该检测灵敏度与临床标准方法qPCR相比几乎一致，但反应耗时比qPCR更短。例如，Cas13a/crRNA系统可以在反应10分钟内检测到荧光信号，而qPCR则不能(图2D)。然后，作者将103拷贝/μL的HBV质粒经过20次重复试验，发现Cas13a/crRNA检测系统的标准差较低，重复性较好(图2E)。最后，作者采用103IU/mL的不同类型临床样本对Cas13a/crRNA检测系统的特异性进行评估，采用不同浓度临床样品(104、103、102、101、＜10 IU/mL)对Cas13a/crRNA检测系统的灵敏度进行评估，发现所构建的Cas13a/crRNA检测系统在特异性和灵敏度上均能满足临床样品的检测需求(图2F)。
图2. Cas13a/crRNA系统检测HBV DNA的性能测试
作者以终点荧光信号强度为判断标准对Cas13a/crRNA检测过程进行了优化。首先作者对比测试了不同的样本裂解时间(5, 15, 30, and 60 min)和样本裂解温度(25, 37, 56, and 95°C)，发现最佳的样本裂解时间是15 min，最佳的样本裂解温度是37°C(图3A)。然后，作者也对样本保存天数进行一系列的测试(0, 1, 3, 5, and 7 days)，发现新鲜血浆样本效果最好(图3B)。紧接着，作者对RAA反应时间(5, 15, 30, 45, 60 min)、温度(25, 33, 36, 39, 42, 45°C)和模板体积(2, 4, 6, 10 μL)进行对比测试，发现加入6 μL扩增模板，39℃扩增30 min时荧光值最高(图3C)。接下来，作者对CRISPR反应时间(10, 20, 30 min)、温度(25, 28, 31, 34, 37, 40, 43°C)进行了优化，发现37°C反应效果最佳，反应需在30 min内完成(图3D)。K1、K2和K3分别代表了CRISPR反应10 min、20 min和30 min荧光曲线的斜率，可以反映剪切效率。此外，作者还对比了血浆和血清对检测结果的影响，发现血浆的效果更好(图3E)。综上，作者完成了HBV DNA检测系统的优化工作，并在后续步骤中采用优化好的条件进行试验。
为了评估Cas13a/crRNA试纸条检测的有效性，作者选择HBV感染的LLV患者进行临床验证。结果显示，健康人和未感染个体的结果为阴性，而LLV患者的结果为阳性(图5A)。此外，对比qPCR、Cas13a/crRNA试纸条检测和Cas13a/crRNA荧光检测三种方法，Cas13a/crRNA试纸条检测在LLV患者HBV DNA检测中的阳性符合率约为87%，阴性符合率为100%。值得注意的是，当LLV患者的HBV DNA水平超过100 IU/mL时，Cas13a/crRNA试纸条检测阳性符合率达到100%(图5B)。
为了进一步评估Cas13a/crRNA试纸条检测的有效性，作者增加临床验证样本数量，选择23个CHB抗病毒患者(111例)动态血浆样本进行试验。qPCR检测结果显示了不同服用抗病毒药物患者不同时间点血浆HBV DNA的变化趋势(图6A)。Cas13a/crRNA试纸条检测与qPCR检测结果进行对比，发现每个患者对应动态时间点的Cas13a/crRNA试纸条检测结果与qPCR结果一致(图6B)。此外，采用qPCR作为HBV DNA检测标准，Cas13a/crRNA试纸条检测CHB抗病毒患者动态样本中HBV DNA的灵敏度、特异性、阳性符合率(PPA)、阴性符合率(NPA)值分别为100%、92.15%、93.75%和100%(图6C)。
参考文献：
[1].Tian Y, Fan Z, Xu L, Cao Y, Chen S, Pan Z, Gao Y, Li H, Zheng S, Ma Y, Duan Z, Zhang X, Ren F. CRISPR/Cas13a-assisted rapid and portable HBV DNA detection for low-level viremia patients. Emerg Microbes Infect. 2023 Dec;12(1):e2177088.
