每篇文章的第一张图和题目摘要一样重要，好的工作总是清晰明了地介绍本文的逻辑思路。这篇EXTRA-CRISPR的方法就包括Padlock probe+target miRNA杂交，DNA Ligase连接，RCA滚环复制，最后是CRISPR信号输出和放大。和之前常见的Padlock probe思路不一样的点在于，见上图b，RCA扩增的产物经过Cas12a顺式切割后，得到的断裂后的ssDNA产物同样可以行使target miDNA的作用，继续进行正反馈循环放大，进一步提高RCA扩增效率和检测灵敏度。所以说，可以预见，EXTRA-CRISPR的检测灵敏度一定比之前的方法更高，这也可能是发表于NBE的原因之一吧。
考虑到RCA产物中，除了有大量的ssDNA外，还会有不少dsDNA序列，而对dsDNA靶标的识别则依赖PAM位点。为此，作者做了一个实验，选择在Padlock序列上添加或不添加PAM位点，然后测试EXTRA-CRISPR的检测灵敏度。结果表明，添加了PAM位点之后，检测灵敏度更高。而且，short-cut的RCA产物对EXTRA的促进效果更好。作者也在上图I中提出了假说，即long-cut的产物与Padlock probe的结合方式有两种，分别形成circular和linear类型，而只有circular才能更好地启动RCA复制，再次激活EXTRA-CRISPR体系。而相反，linear的扩增效果则差的多。
作者紧接着测试了几种不同的检测体系，分别是RCA only（灵敏度最差，只有1nM），three-step（LoD=1pM），two-step（LoD=1pM）以及one-step/pot（100 fM）。原理嘛，肯定也是很简单的，就是把Ligation，RCA和CRISPR-Cas12a放在一管体系中之后，才有机会能够启动secondary激活机制，即让Cas12a的切割产物再次激活RCA；相反，两步和三步反应中，Cas12a的切割和RCA都是割裂开的，无法形成正反馈激活的。所以，检测灵敏度自然就低了1个数量级。不过，只要加了CRISPR步骤，其灵敏度就比RCA提高了1000倍，说明Cas12a反式切割活性的放大效果还是很不错的。
紧接着，作者以靶标miR-21的检测为例，进一步优化了EXTRA-CRISPR体系。其中，包括Padlock probe的设计位置（a），Ligase的选择（b，选了SplintR），以及Phi29酶、Padlock Probe、Cas12-crRNA (RNP)和 reporter的浓度，反应时间等等，各种条件优化，最后提高该体系的检测灵敏度。上图（k）还强调了EXTRA-CRISPR体系的特异性，不过，这里要说明的是，该系统的特异性实际上和CRISPR关系不大。CRISPR在这里只是起到了信号放大和提升检测灵敏度的作用，而特异性则主要是由SplintR连接酶（PBCV-1 DNA Ligase）来决定的。
在高灵敏和高特异之后，对于EXTRA体系来说，下一步需要证明的就是定量了。作者用EXTRA和RT-qPCR进行了平行比较，检测sEV（small EV）中的靶标miRNA，并且发现绝大部分情况下，两种定量方法的一致性还是不错的。不过，针对某些靶标，如miR-196a，作者发现只有EXTRA方法可以有效检出，而RT-qPCR方法则未能检出（上图h）（我觉得这里测试的靶标数量有点少，还不能就此说明EXTRA的性能全面超过RT-qPCR）。上图d也再次证明了EXTRA的特异性。
作者紧接着检测了PDAC患者（胰腺癌）和健康人组的EV种几种靶标miR的表达水平，还是以RT-qPCR为参照（少了miR-196a，检不出来）。并且，作者在这里综合了4种miR的表达水平，提出了EV-Sig指标（大家感兴趣的话，可以找原文研究一下算法），发现EV-Sig的AUC和RT-qPCR的AUC值非常接近，0.853vs0.874，因此，证明了EXTRA方法在未来的可实用性。
这篇工作开发了基于CRISPR-Cas12a的miRNA快检方法，特异、精准、便捷。整篇文章的设计思路非常清晰、系统，值得学习。
1. 本文大的创新点不多，之所以还列为经典，是因为目前CRISPR诊断的经典工作越来越少。这也符合技术发展的规律。刚开始的时候，肯定是技术原理上有突破，后来再是各种应用和各种补丁。CRISPR诊断技术又非常简单，想原理上不停突破的话，太难了。后续可能就是一管多重和免扩增了，大家且研且珍惜。
2. 这里用到的研究思路，前半部分，其实之前已经有不少工作都提出来了，包括Padlock Probe的设计，以及用RNA引物来启动Phi29的延伸等等。大家有兴趣的话，可以去读下相关文章。后半部分，利用Cas12a的反式切割来提高灵敏度，以及Cas12a的顺式切割产物可以进一步激活RCA复制，这部分是比较创新的。所以说，每篇工作，都很难说全部创新，其实只要有一两个创新点就已经很不错了。
3. SplintR=PBCV-1 DNA Ligase，可以RNA-dependent DNA Ligase（第一步连接），也可以是DNA-dependent DNA Ligase（第二步连接）。该酶在以RNA为模板时，连接效率貌似比T4 DNA Ligase高很多，值得关注。
4. 这里miRNA的检测方法，作者对比了RT-qPCR（加A法）和EXTRA方法。其实，RT-qPCR的方法也分很多种，还有茎环法，连接酶法等等。本文的EXTRA方法能否成为未来的主流方法，值得期待！至少是学术上可以先行先试。
5. 貌似NBE这两年发表了不少CRISPR诊断的工作。大家可以多关注一下。
参考文献：
[1].Yan H, Wen Y, Tian Z, Hart N, Han S, Hughes SJ, Zeng Y. A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs. Nat Biomed Eng. 2023 Dec;7(12):1583-1601. doi: 10.1038/s41551-023-01033-1. Epub 2023 Apr 27. PMID: 37106152; PMCID: PMC11108682.
