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开发能够控制CRISPR-Cas9活性的技术，以在特定阶段激活或抑制基因，这对于发育生物学等领域的研究具有重要意义。有关这方面的研究有什么最新动态呢？大家随小编一起，来看看今天的文章吧~
目前多种CRISPR-Cas9活性的时序控制策略已开发，例如通过融合蛋白的不稳定结构域来实现Cas9的时序控制，以及通过小分子控制适配体融合-sgRNA活性的方法等。然而，这些系统在合成上较为复杂，需要大量的工作。近日，来自美国奥尔巴尼大学的Maksim Royzen教授团队描述了一种基于生物正交化学法调控CRISPR-Cas9活性的方法，研究论文“Reversible RNA acylation using bio-orthogonal chemistry enables temporal control of CRISPR-Cas9“发表在ACS Chemical Biology 期刊。
作者设计了一系列实验来验证CRISPR-Cas9活性的可控性。化学机理如图1A，首先利用反式环辛烯-酰基咪唑试剂（TCO-Im）对RNA进行乙酰化，将TCO基团随机引入RNA的2'-OH上，实现对CRISPR向导RNA（sgRNA）的“隐身”（cloaking），并通过1,2,4,5-四嗪-3,6-二甲胺（Tz）触发的生物正交反应实现“现身”（uncloaking）。
作为概念验证，作者首先用TCO-Im（图1B）在37°C下处理模式18-nt RNA寡核苷酸1、2 、4 小时。由于TCO-Im在水中溶解度较差，因此反应在DMSO和H2O的1:1溶液中进行。随后，用乙醇沉淀法纯化RNA，并通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）分析其酰化谱。结果如图1B所示，模式RNA与TCO-Im的非特异性2'-酰化速度很快，而且暴露于酰化试剂的时间越长，RNA修饰的程度越高。随后，作者测试了先前经过4小时“隐身”处理的模式RNA的解隐性。结果如图1B所示，RNA在37°C的PBS（pH 7.2）中用Tz处理，1 h处理，未能实现完全解隐，2h处理，可提高完全解隐RNA的产量。
接下来，作者评估了使用生物正交化学方法控制CRISPR-Cas9活性的可行性。对设计的用于线性化eGFP-N1质粒的sgRNA1进行酰化后，再进行体外CRISPR实验。条带 3、5、7分别为用TCO-Im在37℃下处理1、2和4小时的样本。结果表明，1小时酰化后，sgRNA1活性降低了约4倍；2小时及4小时酰化后，sgRNA1几乎没有活性。条带4、6、8分别为用TCO-Im在37℃下处理1、2、4小时后，又用Tz处理1、2、4小时的样本，结果表明，Tz处理后没有完全恢复sgRNA的活性。作者认为这可能由于sgRNA1较18-nt模型RNA序列更长，具有更复杂的酰化特征，所以需要更长的时间才能实现完全“现身”。
作者随后进行了体内验证实验。考虑到sgRNA的稳定性会受到体内核酸酶的影响，作者使用2'-OMe基团对sgRNA进行位点特异性修饰，且修饰的位置不会明显干扰sgRNA和Cas9之间的天然结合。新合成的sgRNA2重复上述“隐身”和“现身”实验，并测试了Tz处理的不同浓度。结果如图3所示，条带4为TCO-Im处理2小时样本，结果表明，在相同时间内，sgRNA2相比于sgRNA1失活程度更低，作者认为这是由于sgRNA2中可用于酰化的2'-OH基团较少，其中包含59个2'-OMe基团。另外条带5、6、7分别是50 mM、5 mM、1 mM Tz处理样本，2小时处理后，几乎都恢复了sgRNA2的活性。
最后，作者将该体系应用于细胞实验，将sgRNA和编码Cas9的mRNA共转染至表达GFP的HEK293T细胞中。分别进行了两组实验，一组采用未处理过的sgRNA2，另一组采用TCO-Im处理了2 h的sgRNA2。流式分析GFP的表达，结果显示，与未处理的细胞相比，转染了sgRNA2的细胞GFP表达明显降低，而转染了TCO-Im处理sgRNA2的细胞，其GFP表达水平受干扰程度最低，这表明隐身后的sgRNA2活性减弱。作者继续对“现身”反应条件进行优化，包含不同浓度的Tz（10-50 μM），不同处理时间（2-48 h）等。流式分析结果表明，50 μM Tz作用2 h效果最佳（图4D）。
参考文献：
[1] Pandit B, Fang L, Kool ET, Royzen M. Reversible RNA Acylation Using Bio-Orthogonal Chemistry Enables Temporal Control of CRISPR-Cas9 Nuclease Activity. ACS Chem Biol. 2024 Aug 16;19(8):1719-1724. doi: 10.1021/acschembio.4c00117. Epub 2024 Jul 25. PMID: 39051564; PMCID: PMC11334111.
