作者首先基于AlphaFold和SWISS-MODEL，以已解析的BthCas12b的结构为基础，成功预测了BrCas12b的结构。然后作者通过DeepDDG软件分析了不同AA残基突变后的吉布斯自由能的变化，并找出了3个最有可能的AA，即F208，L795和T874，可进行后续的进一步研究（这个思路蛮好的，包括软件和方法，可以借鉴）。当然，除了这3个外，还有一些位点也值得分析。
作者进一步测试了不同突变体在高温下的one-pot效果（RT-LAMP+Cas12b），以野生型BrCas12b为对照。结果显示，WT BrCas12b在64度以上就完全失去活性，而多个突变体都可以达到67度。另外，作者还测试了RFND突变体对PAM的依赖性，发现在不进行LAMP扩增时，该突变体还是相对依赖的，但是如果进行LAMP扩增的话，这种依赖性则会大大降低（可能是扩增时会形成部分ssDNA产物，从而不依赖于PAM位点？）
这篇工作是Jain团队在耐高温BrCas12b蛋白鉴定的基础上，又通过对其进行突变改造，筛选获得了更耐高温的BrCas12b突变体，进而构建了高效的SPLENDID一步法快检系统。
这篇文章里面发现的多个突变体都可以耐受更高的温度，这样证明了这篇文章的改造思路是可行的，包括其改造逻辑和用到的工具都值得学习。大家如果对蛋白定点改造，特别是想提升目的蛋白的耐热性的话，不妨借鉴一下。
参考文献：
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