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异常的DNA甲基化和各种疾病的发生发展相关，对其进行精准检测对于疾病的诊断和监测具有重要的意义。那么如何利用CRISPR技术实现对DNA甲基化进行检测呢？带着这个问题，随小编一起来看看下面的文章吧~
近年来，人们已经开发了多种基于CRISPR技术的DNA甲基化分析方法，包括HOLMESv2、DESCS、MSREs-Cas12a、E-PfRPA/Cas、CAM和GlaI-DC-SDA-CRISPR-Cas12a。这些方法主要利用亚硫酸氢盐或特定的内切酶对DNA样品进行预处理，但是亚硫酸氢盐易导致DNA降解，内切酶依赖于特定的识别位点，限制了对任意目标CpG位点的检测。因此，有必要构建一种新的系统，用于快速、方便、灵敏地检测任何CpG位点的甲基化。
针对于此，深圳市第二人民医院和上海吐露港研究团队，共同开发了一种基于TET2/APOBEC和CRISPR-Cas12a的新型DNA甲基化检测方法，命名为meHOLMES (methylated DNA HOLMES)，可实现对甲基化DNA的任意位点检测。
meHOLMES检测体系主要包括两个部分：DNA样品预处理和信号读取。在DNA样品预处理方面，TET2首先通过氧化作用将5mC转化为5caC，而未甲基化的胞嘧啶不受影响。随后，通过甲酰胺将双链DNA变性为单链DNA。接着在APOBEC的作用下将胞嘧啶（C）脱氨为尿嘧啶（U），这些尿嘧啶在PCR扩增过程中进一步转变为胸腺嘧啶（T）。而5caC由于不能被APOBEC脱氨，在PCR之后仍为C。因此，预处理过程仅将未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，而CpG位点内的5mC未转化。
meHOLMES的信号读取依赖于CRISPR-Cas12a特异性识别预处理过的DNA序列，通过理性地设计crRNA使得Cas12a/crRNA复合物只识别胞嘧啶未转变的目标序列，最后以荧光的方式或试纸条的方式对结果进行输出（图1）。
初步建立meHOLMES检测体系后，作者分别对该体系的特异性和对不同比例甲基化DNA的检测能力进行研究。荧光检测和侧流层析试纸条的结果均表明，meHOLMES具有高度的特异性和对不同比例甲基化DNA的检测能力（图2）。
图2.meHOLMES检测不同比例甲基化DNA和特异性分析
进一步，通过一代测序和随机选取同个基因的不同甲基化位点，证明了meHOLMES可以实现对甲基化DNA任意位点的检测（图3）。
图3.meHOLME检测不同DNA甲基化位点
作者利用meHOLMES来检测真实生物样本中COL1A2基因启动子M3位点的甲基化水平，包括宫颈癌细胞（HeLa）、结肠直肠腺癌细胞（SW480和HCT116）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、肝癌细胞（Huh7和97H）以及人正常肝细胞（LO2）。提取的基因组DNA首先经过TET2/APOBEC处理和PCR扩增，然后使用荧光仪器或试纸条进行Cas12a检测。结果显示，COL1A2启动子M3位点在肿瘤细胞中的甲基化水平显著高于正常细胞（图4）。
图4.meHOLMES检测真实生物样本
表1.基于CRISPR系统的不同DNA甲基化检测方法比较
参考文献：
[1].Zhuang SK, Hu TS, Zhou XK. meHOLMES: A CRISPR-cas12a-based method for rapid detection of DNA methylation in a sequence-independent manner. Heliyon. 2024 Jan 30;10(2):e24574. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e24574.
