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CRISPR/Cas12a已经被大家熟知，其主要功能是在crRNA的引导下精准识别并剪切靶标dsDNA或ssDNA，并被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，可剪切体系中的ssDNA报告探针产生信号。其它Cas12家族蛋白也有类似的功能，包括Cas12b、Cas12f（Cas14）等。与它们不同的是，有些Cas蛋白是guide RNA介导的RNA内切核酸酶，例如Cas12a2、Cas13，它们识别的靶标为RNA。虽然识别对象不同，但并不是“Cas12仅用于检测DNA，Cas13仅用于检测RNA”，在实际应用中可以通过逆转录/转录及相关的预扩增方法快速实现RNA和DNA靶标的相互转化。例如，通过RT-PCR、RT-LAMP、RT-RPA等将RNA靶标转化为dsDNA扩增产物，然后用Cas12a进行检测。那么，能否在不通过反转录的情况下用Cas12a检测RNA靶标呢？今天给大家介绍的这篇文章提出了一个新思路！
这篇文章来自佛罗里达大学 Long T. Nguyen & Piyush K. Jain研究团队，文章标题为“Programmable RNA detection with CRISPRCas12a”，于2023年9月发表在Nature communications杂志上。在这篇文章中，作者提出了Cas12a识别靶标的新机制，即PAM近端识别靶标为DNA时，远端序列无论是DNA或RNA都可以被Cas12a识别，并通过这种近端/远端分裂的核酸序列共同激活Cas12a的反式剪切活性。因此，可以不经过逆转录，直接将Cas12a用于RNA靶标的快速检测，作者将该技术命名为SAHARA（Split Activator for Highly Accessible RNA Analysis）。SAHARA检测RNA靶标不需要样本预扩增、逆转录或链置换，且灵敏度可以达到pmol水平。此外，该系统对SNP位点检测的特异性也有所提高，是一个简单而强大的基于Cas12a的RNA检测平台，并有可能扩展到其他CRISPR/Cas系统。
LbCas12a、AsCas12a和ErCas12a是几种较为常见的Cas12a，虽然来源不同，但是Cas12a家族的基本特征非常相似，它们的成熟crRNA长度均为41-44 nt，包含19-21 nt的Direct Repeat区（DR区，不同来源的Cas12a DR区高度保守），以及能与靶标互补配对的Spacer区~20-24 nt。作者首先将crRNA Spacer区对应的识别序列分裂成PAM近端（Pp）种子区或PAM-远端（Pd）序列。在以ssDNA为识别靶标的前提下，设计了6-20 nt的不同长度的短ssDNA序列，并测试了Lb、As、Er三种不同来源Cas12a在单个被截断的ssDNA激活物存在下的反式剪切活性，结果表明当ssDNA长度超过14 nt时才能够激活Cas12a的反式剪切活性，而短于14 nt的ssDNA不会激发Cas12a的反式剪切（图1b-d）。接下来，作者测试了同时添加两条截断的ssDNA激活剂，分别结合到crRNA的不同区域，共同模拟一个全长的靶标序列，检测两条截断的ssDNA组合起来是否能够恢复Cas12a的反式剪切活性。结果表明，当两条截断的ssDNA组合长度大于或等于20 nt时，可以启动Cas12a的反式剪切活性（图1e-g）。
图2.多种split target方式对Cas12a反式剪切活性的影响
之前，作者已经证明，在crRNA的3′端添加一个7 nt的DNA延伸，可以显著提高LbCas12a的反式切割活性。因此，在本研究中，作者也测试了野生型crRNA与增强型crRNA（Enhance crRNA）的差别。结果表明，Enhance crRNA可以提高LbCas12a反式剪切活性，但对AsCas12a和ErCas1a2a系统没有影响（图3f-h）。
基于以上研究，作者开发了一种用Cas12a直接检测RNA的检测技术，命名为SAHARA。其基本原理是利用一条12-nt含PAM的dsDNA激活剂（因其长度命名为S12）结合到crRNA的Pp端，而任何目标RNA序列都可以在Pd端检测到（图1a）。为了明确SAHARA可检测的RNA靶标序列的长度，作者设计了两个RNA靶点：一个短RNA (20 nt)和一个更长的RNA（~730 nt），两者包含相同的20 nt靶标序列（图4a）。结果表明，直接用经典的Cas12a/crRNA复合物识别RNA靶标时，几乎不产生反式剪切信号（AsCas12a除外）；但用SAHARA技术能够稳定地检测到不同长度的RNA靶标。ErCas12a对短RNA和长RNA靶标的检测均信号均较高，而AsCas12a表现最差。LbCas12a对短RNA靶标具有良好的活性，但随着RNA长度的增加，其表现明显变差（图4b-d）。进一步的，作者还采用一段干扰的S12（即Scr），与S12相比，Scr不显示任何RNA检测活性，证实了Cas12a/crRNA系统的激活依赖于序列正确的S12（图3e-g）。
图4.SAHARA体系可用于短RNA或长RNA检测
随后，作者采用ErCas12a对SAHARA体系进行了优化。首先是crRNA长度，作者测试了24，26，28 nt的crRNA，发现24 nt效果更好。反应温度37°C和室温（RT）对比，发现室温会导致活性降低了3-5倍。Mg2+浓度为15 mM时效果最佳，超过该浓度就会轻微降低活性。最后，该反应的pH值为7.9时最佳，随着pH的进一步增加或降低，活性都会急剧下降（补充数据，未展示）。
HCV病毒感染会引起肝脏炎症，并可导致严重的并发症，如肝损害、肝硬化和肝癌。因此，HCV的早筛早诊是很重要的。作者采用在多个HCV基因型中都保守的一段短RNA序列作为靶标，设计了三种不同的SAHARA crRNA（图5a）分别靶向该保守序列的5′端（head）、 3′端（tail）和中间段（mid）。检测结果表明，靶向HCV尾部的crRNA活性较高（图5b）。采用不同浓度的RNA靶标测试SAHARA体系的灵敏度，发现其对HCV的检测限为132 pM（图5c）。
miRNA-155在乳腺癌进展中发挥关键作用，并在乳腺癌组织中过表达。因此，miR-155的可靠检测对乳腺癌诊断意义重大。成熟的miR-155的长度为~23-nt。作者合成了成熟的miRNA靶标，并设计了两种SAHARA crRNA，分别靶向其5′端（head）和3′端（tail）。检测结果表明，靶向miR-155头部的crRNA活性较高（图5e）。采用不同浓度的miRNA靶标测试SAHARA体系的灵敏度，发现其对miR-155的检测限为767 pM（图5c）。
这些结果与之前使用Cas12a对ssDNA或dsDNA的免扩增检测限相似。之前研究表明，利用多个crRNA可以提高CRISPR体系的检测灵敏度，作者在这里也证实了这一点（pool表示几种crRNA的混合物）。需要说明的是，本研究中对HCV靶点进行的所有实验都是用一个86-nt长的RNA完成的。由于RNA的长度会影响SAHARA的检测性能，所以该结果不能代表SAHARA检测真实临床样本的情况。
图5. SAHARA体系用于HCV病毒和miR-155检测
与常规的CRISPR/Cas12a检测系统（识别一条完整的ssDNA靶标）相比，作者推测SAHARA系统（在含PAM dsDNA近端序列协助下识别远端ssDNA/或ssRNA靶标）可能具有更高的SNP位点识别能力。为了验证这一点，作者带有单点突变的24-nt ssDNA用于WT CRISPR/Cas12a系统，以及带有单点突变的12-nt ssDNA用于SAHARA系统（图6a-b）。结果表明，与WT CRISPR/Cas12a系统相比，SAHARA系统对单点突变更加敏感，尤其是接近split边界的突变位点（图6c-e）。
图6.SAHARA体系可提高对SNP位点的检测性能
为了验证SAHARA对PAM的依赖性，作者分别设计了三种不同的S12激活序列， 分别包含TTTA、AAAT或VVVN PAM（图7a）。TTTA是LbCas12a和AsCas12a的典型PAM之一，而Er则是偏好YTTN PAM。将PAM从TTTA变为AAAT或VVVN后，LbCas12a和AsCas12a的反式剪切活性完全减弱。有趣的是，ErCas12a能够在AAAT或VVVN PAM条件下检测到RNA，这表明其PAM耐受性比以前报道的更广泛（图7b-d）。间隔区的GC含量之前被证明会影响Cas12a酶的活性。作者推测S12激活序列的GC含量会影响SAHARA检测性能。为了验证这一点，作者设计了不同的S12激活序列，GC含量从25%到75%不等。结果3种Cas12a都能耐受GC含量的变化（图7e-g），这意味着Cas12a也可能用于检测不同GC含量的RNA。最后，作者测试了能够启动SAHARA检测的S12的最小浓度低至50 pM，S12对于反式剪切活性的启动至关重要，可以作为选择性地开启或关闭该活性的开关（图7h-j）。
图7.S12可作为SAHARA检测系统的开关
首先作者将一组crRNA集中于同一个SAHARA系统，当不同的S12激活序列存在时，可以检测到TargetA、B、C单独存在或混合存在的多种情况（图8a-d），证明SAHARA可用于多重检测。最后，作者使用Cas12a与PsmCas13b一起检测了两个不同的RNA靶点（T1和T2），其中Cas12 crRNA仅与T1靶点互补，而Cas13 crRNA仅与T2互补（图8e），结果表明该2重SAHARA体系可以成功检测单独或同时存在的T1和T1靶标，产生的反式切割信号通过FAM和HEX荧光通道区分，具有良好的正交性（图8f-g）。
图8.SAHARA系统用于多重核酸检测
参考文献：
[1].Rananaware SR, Vesco EK, Shoemaker GM, Anekar SS, Sandoval LSW, Meister KS, Macaluso NC, Nguyen LT, Jain PK. Programmable RNA detection with CRISPR-Cas12a. Nat Commun. 2023 Sep 5;14(1):5409.
