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如何突破CRISPR/Cas12a系统SNP检测的PAM近端位置局限，实现PAM远端的SNP检测呢？带着这个问题，大家跟随小编的脚步，一起来看看研究者们在这方面的探索吧~
在CRISPR工具箱中，具有DNA靶向识别能力和反式剪切活性的Cas12家族被认为在核酸检测或分子诊断领域具有强大的作用。然而，Cas12a系统对crRNA间隔区（spacer）和靶DNA链之间错配的高耐受性对其特异性检测和准确诊断构成了一定的风险，尤其是需要区分SNP位点的场景下。
此前研究报道CRISPR/Cas12a系统可检测的SNP位点主要集中在PAM位点附近，而非PAM远端的位置，特别是单碱基突变。今天给大家介绍的这篇文献则利用两条短单链DNA的协同检测PAM远端的SNP位点。该文章发表在Analytical Chemistry期刊，标题为“Synergistic Incorporation of Two ssDNA Activators Enhances the Trans-Cleavage of CRISPR/Cas12a”。
作者首先提出自己的原理示意图，两条单独的短单链DNA同时存在可以激活CRISPR/Cas12a的反式剪切，而其中任何一条都太短，不能独立激活CRISPR/Cas12a系统（图1）。作者将它称为“协同激活效应”。这一发现不仅加深了研究者们对CRISPR/Cas12a识别和剪切机制的了解，而且可以促进其应用。
图1. 协同激活CRISPR/Cas12a系统的原理示意图
为了验证不同单链DNA的长度和序列对CRISPR/Cas12a系统切割活性的影响，作者使用了一系列的不同长度的ssDNA激活子与crRNA的杂交。完整的ssDNA的（与crRNA spacer区互补的序列）长度为20 nt，用T20表示，作者将其单独从5’端截短到不同的长度：18 nt，16 nt，14 nt，12 nt，结果表明长度缩短至12 nt时活性接近对照组（图2A）。这是因为当ssDNA底物太短（小于约14 nt）时，不能与crRNA形成一个稳定的杂交结构，因此不能启动Cas12a活性。接下来，作者又从T20的3’端进行一系列截短（图2B），以及同时从5’端和3’端截短（图2C），都得到类似的结果。然而，当截短的长度相同时，5’端截短的3’TX的激活效率最高，其次是双端截短的cTX，最后是3’端截短的5’TX（激活效率，3’TX>cTX>5’TX）（图2D）。
图2. 单链DNA长度及序列位置对激活CRISPR/Cas12a系统的影响
随后，作者验证了不同长度下不同突变位点对CRISPR/Cas12a系统切割活性的影响，结果表明突变越靠近发卡结构时影响越大（图3）。
图3. 单链DNA突变位置对激活CRISPR/Cas12a系统的影响
作者接着验证了两条不同长度组合对CRISPR/Cas12a系统切割活性的影响，结果表明两条短链长度均为10 nt时，组合协同导致的CRISPR/Cas12a系统切割活性最强，且两条短链单独都不能激活CRISPR/Cas12a系统（图4）。
图4. 两条单链DNA不同长度组合对激活CRISPR/Cas12a系统的影响
作者确定了两条单链DNA长度组合对激活CRISPR/Cas12a系统的最优方案后，进一步探索错配个数对CRISPR/Cas12a系统的影响，结果表明，两条短链DNA上的单个碱基错配都会降低CRISPR/Cas12a系统的反式剪切活性，当两条短链DNA上出现两个错配时，其荧光信号与对照无差别（图5）。
图5. 两条单链DNA错配个数对激活CRISPR/Cas12a系统的影响
根据以上实验结果，作者设计了两段单链DNA用于检测SNP位点。值得一提的是，为了增加SNP位点区分能力，作者在其中一段短链DNA（Helper strand H）上引入了一个辅助错配，使其与野生型靶标之间存在1个错配位点，与突变型之间存在2个错配位点（图6A）。结果表明，CRISPR/Cas12a系统能够区分WT和MT样本；当MT样本浓度逐渐升高时，荧光信号也逐渐升高，在0.05～15 nM范围内，FAM荧光强度（在518 nm处）与MT浓度呈线性关系（图6E），最低检出限为29 pM。接下来，为了进一步验证Cas12a/crRNA系统在MT和WT混合物中选择性检测MT的能力，作者对MT的不同突变丰度（0−100%）进行了荧光分析，结果显示能最低检测出丰度为0.2%的突变型。这些结果表明，协同激活方案对SNP具有良好的识别能力。
图6. 额外单链DNA对检测突变的影响
本文中作者提出了一种“协同激活剂效应”，通过两条短的DNA单链核酸与crRNA杂交协同激活CRISPR/Cas12a系统。在逻辑门的背景下，两条短的DNA单链核酸的双输入激活的CRISPR/Cas12a切割原则上具有可以同时监测任何两个ssDNA靶点的潜力，这也可以扩展到对暴露的ssDNA的门控切割。此外，这种协同激活剂触发的CRISPR/Cas12a系统被证实具有明显的SNP位点辨别能力，无论突变单核苷酸的位置如何。这种“协同激活剂效应”为细化其特异性提供了一种新的策略，从而有助于扩大分子诊断应用的范围。
参考文献：
[1] Li Q, Song ZL, Zhang Y, Zhu L, Yang Q, Liu X, Sun X, Chen X, Kong R, Fan GC, Luo X. Synergistic Incorporation of Two ssDNA Activators Enhances the Trans-Cleavage of CRISPR/Cas12a. Anal Chem. 2023 Jun 13;95(23):8879-8888.
