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CRISPR/Cas诊断（CRISPR-Dx）面临着超短核苷酸检测困难、预扩增依赖性、交叉污染、现场检测存在不足以及非核酸靶标检测困难等多重挑战。本文作者综述了解决上述问题的CRISPR RNA（crRNA）设计的研究进展，强调了该领域研究的挑战、机遇和未来方向。
近年来，CRISPR/Cas技术在医药、农业、环境监测和食品安全检测等领域展示出巨大潜力。新近开发的CRISPR/Cas检测方法具有低成本、超灵敏、超特异，现场易操作、多功能、分散式检测等特点，使我们能够更可靠、更快速地检测靶标。
广大科研工作者通过使Cas12a或Cas13a与crRNA形成复合物并识别靶核酸序列，激活其非特异性切割活性，输出检测信号进行靶核酸检测。其反式切割信号输出的方法包括荧光、试纸条层析、比色法、光敏和表面增强拉曼散射等（图1）。在CRISPR/Cas的检测体系中，PAM序列依赖性、预扩增依赖以及超短核苷酸检测困难等问题，均会直接影响检测靶基因或病原体的准确性和可靠性，故而越来越多的研究人员把研究重点放在了对crRNA的修饰和重构上，以期改进生物反应性能。
为了提高CRISPR/Cas系统的效率，人们对Cas酶、靶标和crRNA进行了改造。最近，crRNA设计已成为解决CRISPR/Cas中超短核苷酸扩增依赖和气溶胶污染等问题的有效解决方案（表1），涉及五种crRNA设计方法如下：
重构和再功能化crRNA
研究者发现，通过不同长度的ssDNA、ssRNA和硫代磷酸ssDNA来延伸crRNA的3'端或5'端，可以显著提高CRISPR/Cas的靶标识别特异性；通过使用一个长度仅为17个核苷酸的3‘-末端折叠crRNA，可以克服CRISPR/Cas13a在检测超短sncRNA中的局限性。Molina Vargas等发现可以通过缩短或修改crRNA的长度来提高CRISPR/Cas的敏感性和特异性，为更多用户友好型Cas-13a检测系统设计提供了灵感。Safdar等通过在tracrRNA上延伸一段DNA序列，设计了新型的CRISPR复合物。该段延伸的DNA片段可以是催化RNA裂解的DNAzyme分子，也可以作为DNA探针杂交位点。
split crRNA
Moon等发现了非对称CRISPR检测法，即CRISPR/Cas12a内的全长crRNA和split crRNA之间的竞争相互作用可以触发信号级联放大，导致目标检测信号的显著增强，提高了CRISPR/Cas12a靶标检测的灵敏度和有效性。非对称CRISPR检测实现了miRNA的无扩增定量检测，检测灵敏度达856 aM。Shebanova等还发现当crRNA分裂成独立的支架部分和间隔RNA部分时，可使AsCas12a高度特异和高效地切割靶标DNA。此外，该研究还发现，这种基于split crRNA的AsCas12a也具有特异的ssDNA靶标切割和反式切割活性。
化学修饰crRNA
Hu等提出了一种光控crRNA激活方法，显著增强了CRISPR/Cas12a诊断的稳定性。该光反应性CRISPR/Cas确保所有成分都在一个封闭的系统中添加，从而避免了气溶胶污染，提高了检测的灵敏度。Ke等对crRNA的3′端进行2′-甲氧基修饰，有效抑制CRISPR/Cas12a的非特异性亲和性，同时保持高靶向亲和性，降低了CRISPR/Cas12a的脱靶效应。
环化crRNA
Wu等利用环状crRNA开发了一种基于核酸酶激活的CRISPR/Cas12a的新型生物反应平台。在这种方法中，具有RNA切割活性的核酸酶（NAzymes）将环状crRNA切割成线性crRNA后，CRISPR/Cas12a的切割活性被激活，该检测方法灵敏度为100%，特异性为90%，检测限为102 CFU/mL。
与crRNA相互作用
CRISPR/Cas系统的特点使其非常适合于核酸检测，尤其是现场快速检测。crRNA设计为CRISPR-Dx的开发开辟了新的途径，以克服实验室基础研究中的一些挑战。为了更好地发挥其应用潜力，未来的研究可以聚焦在以下几个方面：结合人工智能（AI）和纳米技术等前沿技术，提高自动化和实用性；将CRISPR/Cas生物反应的应用从体外检测扩展到细胞或体内环境；以及将应用场景从传染病检测扩展到癌症、遗传变异等其他疾病检测，以及食品安全检测、环境污染监测和生物危害预警等多个领域。
参考文献：
[1] Ma L, Lu M, Jia J, Wang N, Li Y, Peng W, Man S. Engineered crRNA for CRISPR/Cas-assisted biosensing. Trends Biotechnol. 2024 Jul 8:S0167-7799(24)00153-7. doi: 10.1016/j.tibtech.2024.06.006. Epub ahead of print. PMID: 38981827.
