TOLO智库 | 《Nature communications》：基于靶标特异性扩增和CRISPR的一管多重核酸检测技术

基于CRISPR/Cas12或Cas13反式剪切活性的诊断策略已经被证明具有灵敏、特异、快速、高效、便捷等诸多优势；反式剪切活性又被称为“乱切”，是对体系中任意ssDNA（Cas12家族）/ssRNA（Cas13家族）的一种非特异剪切，因此，在同一反应管中实现多重检测仍是具有挑战的。之前给大家介绍过SHERLOCKv2体系的4重检测，需要在同一反应体系中采用多种不同来源的Cas酶，应用难度较大；此外，研究者们也在探索仅用单一的Cas酶实现一管多重的方案。

今天给大家介绍的这篇文章来自加拿大和美国的研究团队，文章题为“CRISPR-induced DNA reorganization for multiplexed nucleic acid detection”，2023年3月发表在Nature communications杂志上。在这篇文章中，作者报道了一种将功能化crRNA条形码序列的靶标特异性扩增输出与crRNA的转录和CRISPR系统信号读出相结合的策略，命名FACT （Functionalized Amplification CRIPSR Tracing）。FACT可与Cas12a和Cas13a兼容，实现基于顺式或反式剪切的检测信号输出。此外，作者还通过一个可重编程的PAIRing系统（RePAIR）将CRISPR/Cas12a的激活与蛋白质的表达联系起来，进行多种基于蛋白质的信号读取（命名为FACT on RePAIR，FACTOR）。该策略理论上具有检测任何感兴趣核酸靶标的潜力，不受PAM位点的限制，且可以实现一管多重检测。

本文的基本思路是利用一对特殊设计的引物（Fwd和Rev）对靶标DNA或RNA进行特异性HDA或RT-HDA扩增；其中Fwd引物包含T7 promoter和与靶标核酸互补配对的一段序列；Rev引物包含crRNA编码序列（其中红色部分表示间隔区Spacer，根据下游activator序列设计；绿色部分表示直接重复序列Direct Repeat，根据不同来源的Cas12或Cas13酶设计，图1）。

理论上，当靶标序列存在时，HDA或RT-HDA发生，扩增产生无PAM序列的靶标核酸特异性crRNA条形码双链DNA（DNAcrRNA）（其中黑色部分是T7启动子区；灰色部分是靶标特异性区域；绿色和红色部分分别是crRNA的直接重复序列和间隔序列编码区，图2）。DNAcrRNA作为模板，在T7 RNA聚合酶的作用下转录产生crRNA前体（因Cas12a具有pre-crRNA处理能力，因此小编推测该crRNA前体的5’端也会被Cas12a加工处理，形成成熟的crRNA），并产生Cas12a/crRNA复合物，再利用这种核蛋白复合物介导检测信号的释放。简单来说FACT包含以下流程：① HDA或RT-HDA扩增获得靶标特异性的crRNA条形码扩增产物；② crRNA条形码的体外转录；③ crRNA介导CRISPR体系读取信号。在基于CRISPR体系的信号读取阶段，作者展示了3种策略：

第一种是利用Cas12a的顺式剪切，将crRNA可识别的activator设计成带有PAM位点的双链DNA分子信标探针（molecular beacon），因此可以通过不同荧光基团标记的beacon探针实现多重检测体系。

第二种策略则是利用Cas12a或Cas13a的反式剪切，在体系中人为添加crRNA对应的dsDNA activator+ssDNA报告探针（Cas12a）或ssRNA activator+ssRNA报告探针（Cas13a）。由于反式剪切是非特异性的，因此第二种方案实现多重检测有一定的挑战。

第三种策略中作者引入无细胞蛋白表达系统（cell-free protein expression system，CFS）。作者利用FACT作为一种调控因子，设计基于CRISPR的可编程的蛋白表达系统（RePAIR），并将FACT与RePAIR结合的策略命名为FACTOR。如图2，Cas12a的顺式剪切可启动DNA序列重组，使原本沉默的基因得以表达，从而产生荧光、显色、电化学等多种形式的基于蛋白质的信号输出。

首先，作者利用合成的核酸靶标（RNA和DNA）验证了第一种策略，即基于Cas12a顺式剪切进行信号读取。作者设计了靶标核酸特异性正、反向引物。理论上，当靶标核酸存在时，特异性HDA/RT-HDA扩增发生，产生对应的条形码双链DNA并转录获得对应的crRNA，引导Cas12a识别并特异性剪切对应的beacon双链DNA探针，产生荧光信号指示检测结果为阳性；相反，当靶标核酸不存在时，beacon探针的荧光值处于较低水平。作者分别用5 pM RNA和5 pM DNA靶标测试了该体系的信号读取。结果表明，与无靶标的negative对照相比，5 pM RNA或5 pM DNA靶标均能产生显著升高的荧光信号（图3）。

然后，作者验证了第二种策略，即利用Cas12a或Cas13a的反式剪切读取检测信号。当靶标核酸存在时，特异性HDA/RT-HDA扩增发生，产生对应的crRNA，引导Cas12a或Cas13a识别并剪切activator，并激活Cas12a或Cas13a的反式剪切活性，剪切报告探针产生荧光信号指示检测结果为阳性；当靶标核酸不存在时，HDA/RT-HDA扩增不发生，不能产生对应的crRNA，Cas12a或Cas13a不会被激活反式剪切活性，ssDNA或ssRNA报告探针保持完整，荧光值处于较低的本底水平。作者分别用10 nM RNA或DNA靶标测试了该体系的信号读取。结果表明，与无靶标的negative对照相比，10 nM RNA或DNA靶标均能在10 min内产生显著升高的荧光信号（图4）。由于反式剪切是非特异性的，因此第二种方案实现多重检测体系有一定的挑战。

随后，作者验证了RePAIR系统的可成功编程。利用Cas12a交错剪切dsDNA底物，且剪切发生后，PAM近端（proximal）剪切产物会继续结合在Cas12a上，而PAM远端（distal）带有粘性末端的产物会被释放的特点，作者设计了LacZα报告基因的RePAIR系统，当连接酶存在时，distal双链通过粘性末端与新的proximal donor连接，完成重组编程。可行性分析实验表明RePAIR系统的可成功编程（图5b）。在此基础上，作者输入编码crRNA的条形码序列（DNAcrRNA），结果表明DNAcrRNA可以诱导RePAIR，并在第一个小时内清晰检测到信号（图5c）。作者还测试了RePAIR对DNAcrRNA的灵敏度为20 pM（图5d），与其他CRISPR核酸传感平台灵敏度相似。

基于蛋白质的信号输出还有其他多种类型，除了LacZα报告基因，作者还设计了其他的信号蛋白，包括三种荧光蛋白和一种酶。对于BFP、GFP、RFP三种荧光蛋白，作者都成功在CFS系统反应开始后1小时内检测到荧光报告基因的表达（图5e）。作者还设计了一个针对tre37A基因的RePAIR系统。tre37A基因的表达蛋白是一种可将海藻糖分子转化为两个葡萄糖分子的酶，因此能用血糖仪读取检测信号（图5f）。

接下来，作者测试了FACT结合RePAIR是否能进行一管多重检测。作者采用等摩尔DNA 100 nM浓度截断的RFP、BFP和GFP荧光蛋白基因，以及各自的供体近端链（proximal donor）。将合成的DNAcrRNA加入到混合体系中，诱导对应的RePAIR，孵育1小时后加入到CFS中使蛋白表达。结果表明，在单个DNAcrRNA或多个混合DNAcrRNA输入的情况下，都能在每个相应通道中检测到特异性荧光信号，显示出FACTOR策略的高特异性和一管多重的检测能力（图6a）。

最后，作者将FACTOR技术用于蜜蜂病毒检测，来评估它在农业病虫害检测领域的应用潜力。蜜蜂是世界范围内重要的传粉昆虫，据估计约30%的农业作物依赖蜜蜂传粉，它们对经济和环境的影响是巨大的。然而蜜蜂的生产力、感知方向的能力、寿命等会受到致病性感染的严重影响（如病毒感染等）。目前，明确的蜜蜂病毒感染诊断方法主要是RT-qPCR，但此法需在实验室基地完成，这为养蜂人的实时监测带来困难。

本研究中，作者针对两种关键的蜂蜜病毒——变形翼病毒（DWV）和以色列急性麻痹病毒（IAPV），建立了FACTOR检测体系（图7a）。首先，作者分别使用DWV的dsDNA合成序列和RNA合成序列，测试了FACTOR体系的灵敏度。结果表明，dsDNA和RNA合成序列的检测限分别能达到50 aM和500 fM（补充材料，未展示）。随后作者用合成序列检测了FACTOR体系的特异性。结果表明，该检测体系对IAPV和DWV RNA靶标有较高的特异性（图7b）。

最后，为了验证FACTOR体系在实际样本中的检测性能，作者对从受感染的蜜蜂蛹和整个蜜蜂中提取的RNA进行了检测，并比较了FACTOR体系与RT-qPCR检测结果的一致性。分离纯蜜蜂病毒（仅DWV或仅IPAV）是具有挑战性的，而且样本经常被多种病毒交叉污染，如图7c所示，IAPV样本只含有IAPV RNA，而DWV样本同时含有DWV和IAPV RNA，因此特异性实验中靶向IAPV的检测体系也会对DWV样本产生检测信号，这一检测结果经RT-qPCR证实，结论一致（补充材料，未展示）。与金标准RT-qPCR相比，FACTOR在DWV测试中成功诊断了19只蜜蜂中的18只，其中1只假阴性（图7d）；在IAPV测试中成功诊断了19只蜜蜂中的18只，其中1只假阴性（图7e）。结果显示FACTOR体系对DWV和IAPV诊断的准确性为94.74%。

图7. FACTOR体系用于蜜蜂病毒DWV和IAPV检测

参考文献：

[1] Karlikow M, Amalfitano E, Yang X, Doucet J, Chapman A, Mousavi PS, Homme P, Sutyrina P, Chan W, Lemak S, Yakunin AF, Dolezal AG, Kelley S, Foster LJ, Harpur BA, Pardee K. CRISPR-induced DNA reorganization for multiplexed nucleic acid detection. Nat Commun. 2023 Mar 17;14(1):1505.