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融合基因在白血病患者中非常普遍，在白血病患者的初诊、确诊、治疗及预后的各个阶段都离不开融合基因的检测！如何通过CRISPR技术实现白血病融合基因的快速检测呢？带着这个问题，随小编一起来看看下面的文章吧~
融合癌基因可以定义癌症的分子改变，对诊断和治疗选择至关重要。目前还没有针对急性早幼粒细胞白血病（APL）、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ ALL）和慢性髓细胞白血病（CML）等融合基因驱动白血病的快速、便捷的分子诊断方法，这对许多资源匮乏的社区医院或医疗机构的及时诊断和有效靶向治疗造成了障碍。以张锋为首的美国多个研究团队利用SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unlock）合作开发了基于CRISPR的融合基因检测方法，用于诊断APL、CML和Ph+ ALL白血病，随后并采用一种系统的方法来验证该检测方法的特异性与灵敏度，证明了该方法在低资源环境下的检测潜力。文章标题为“CRISPR-based rapid molecular diagnostic tests for fusion-driven leukemias”发表在Blood期刊上。
作者首先检测两种常见的PML-RARA融合基因：PML断裂点在6号内含子上的BCR1型，也称为L型，占APL的55%；PML断裂点在3号内含子上的BCR3型，也称为S型，占APL的40%。为了最大限度地提高检测灵敏度和特异性，作者采用了两种设计：（1）特异性RT-RPA：对于每个靶标，RT-RPA引物对结合在两个融合基因的连接侧外显子上，从而实现融合基因的选择性扩增，无脱靶扩增；（2）特异性检测：对于每个靶标的每个亚型，设计了跨越融合基因序列的crRNA，从而仅在含有特异性互补融合RNA序列的样品中激活crRNA-Cas13a复合物的报告基因切割（图1A）。
为了验证在复杂RNA混合物中对靶标的检测效果，作者首先使用表达PML::RARA L型的NB4细胞系和表达S型的APL患者来源的RNA来确定LOD（因为没有表达PML::RARA S型的细胞系）。结果显示，PML::RARA靶RNA的LOD为0.1-0.5 ng，特异性为100% （图1B）。随后作者将PML e3和e6正向引物与RARA e3反向引物放到一个RT-RPA反应中，并将L型和S型的crRNA结合到一个Cas13a检测反应中，开发了一种未知亚型的检测方法，结果仍保持了相似的LOD（图1C）。
研究团队通过临床样本验证了该法的可靠性。使用该法对36例PML::RARA阳性APL患者（S型 16例，L型 20例）和17例经临床RT-PCR证实为PML::RARA阴性样本进行检测，结果显示APL PML::RARA SHERLOCK检测结果与临床PML::RARA RT-PCR检测结果完全一致，PML::RARA阴性样本中无假阳性（图1D-E）。
95%的CML患者中发现的BCR::ABL1 p210的两种常见转录亚型，称为e13a2和e14a2（图2A）。CML BCR::ABL1 SHERLOCK的研究思路和结果与APL PML::RARA检测法相类似，靶RNA的LOD为0.1-0.5 ng，在13例CML患者样本中，CML BCR::ABL1 SHERLOCK结果与RT-PCR结果一致（图2B-H）。
团队进一步测试了SHERLOCK对非学术医疗机构来源样本的检测性能。研究团队从11个国家的诊断资源有限地区获得了44份CML干血斑样本，这些国家无法进行当地BCR::ABL1分子检测。样品以干血点的形式收集在纸卡上，保存139-579天（中位数260天），然后进行RNA提取，并通过CML BCR::ABL1 SHERLOCK和金标准BCR::ABL1 RT-PCR同步进行检测。结果显示，即使使用非标准化收集、运输和储存方案的样品，CML BCR::ABL1 SHERLOCK检测也具有100%的灵敏性和特异性，证明SHERLOCK能够从全球不同的非学术背景下获得的样品中诊断CML（图3B-C）。
大约60%的Ph+ ALL患者携带p190转录本（e1a2），40%的Ph+ ALL患者携带 p210 转录本（e13-a2, e14a2）。因此，检测p210 （e13-a2, e14a2）和p190 （e1a2）对于诊断Ph+ ALL至关重要（图4A）。采用与APL PML::RARA和CML BCR::ABL1 SHERLOCK类似的策略，研究团队为BCR::ABL1 e1a2转录物设计了融合特异性RT-RPA引物和连接特异性crRNA（图4B）。使用合成的e1a2靶RNA，作者确定了靶RNA的LOD为1pM（图4C）。研究团队还证实了该法能对接受4天TKI治疗的同一患者来源的系列监测样本中检测p190转录本。在第一天TKI处理样本中，与背景和对照相比，p190转录本很容易被检测到，与12.5%的外周血转录本IS%结果一致。但在随后几天的TKI处理后样本中，p190转录本检测信号与背景无法区分，与~ < 3% IS结果一致（图4D）。这表明SHERLOCK能够在外周血Ph+ ALL诊断时期检测到BCR::ABL1 p190转录本。
最后，为实现该体系的高效检测，研究团队优化了整个操作流程。
（1） 样本制备
裂解液代替柱式提取试剂盒，避免多次离心。研究团队测试了基于Tris/ igepal的裂解缓冲液和商业裂解缓冲液的实验效果（添加/不添加RNase Inhibitor）。结果显示，使用Lucigen缓冲液+/-RI和Tris/Igepal缓冲液+RI直接裂解含有PML::RARA长亚型的NB4细胞，与Cas13检测30分钟的背景相比，产生了阳性信号；当延长到60分钟的检测时，这些裂解条件产生了与柱纯化RNA相当的信号（图5B）。
（2）目标检测
缩短时间。研究团队首先证实了RT-RPA时间从60分钟减少到15分钟，不会影响检测性能（图5C）。其次，研究团队将RT-RPA和Cas13检测步骤合并为“一锅”反应。BCR: ABL1: e13a2和e14a2靶标在1小时内可有效检测，而e13a2 （KCL-22）和e14a2 （K562）靶标在2小时内可达到有效检测（图5D）。
（3）信号读出
使用试纸条进行现场检测。在没有PML::RARA转录本的情况下，完整的生物素探针被截留在对照带，而在有PML::RARA转录本的情况下，crRNA-Cas13切割的报告基因探针迁移到报告基因带，表明APL检测呈阳性（图5E）。
图5. SHERLOCK优化策略
参考文献：
[1] Vedula RS, Karp HQ, Koob J, Lim F, Garcia JS, Winer ES, Luskin MR, Ghiaur G, Kim AS, Beppu LW, Sala-Torra O, Radich JP, Gootenberg JS, Abudayyeh O, Zhang F, Lindsley RC. CRISPR-based rapid molecular diagnostic tests for fusion-driven leukemias. Blood. 2024 Jul 8:blood.2023022908. doi: 10.1182/blood.2023022908. Epub ahead of print. PMID: 38976877.
