今天我们学习CRISPR诊断免扩增系列的研究工作，来自美国莱斯大学高雪教授团队于2022发表于NCB上。文章通过对Cas13进行改造，提升突变体蛋白的反式切割活性和检测灵敏度。结合电化学，进一步提升检测灵敏度之后，可以实现对灭活临床样本的免扩增直检，而且能够达到aM的灵敏度，因此，该工作也达到了临床应用的水准，也很值得认真研究。
作者首先想到向LwaCas13a蛋白上引入RNA结合结构域（RBD）来提升蛋白对靶标RNA的结合力，便通过在N端和C端引入不同的RBD，共获得了14种突变体，然而绝大部分突变体的活力不仅没有提升，反而出现了下降（有N-4#和N-6#有提升，但是提升的幅度不大）。因此，该思路走不通，作者又进行了下面的实验尝试。
紧接着，作者通过认真严谨周密细致的分析，发现有两个Loop区域离Cas13a的活性中心比较近，可以用来插入上述的RBDs。研究发现Loop1区域的突变株中有2个突变体的活性比较高，分别是RBD#3L和RBD#4L突变体。
在获得了高活性的突变体之后，作者又对reporter探针进行了筛选，这里主要是测试不同长度的reporter对于反式切割活性的影响。研究发现，当reporter长度比较短的时候，比方说U5，突变体和野生型之间的活性差别不大；而当长度变成7nt或者更长时，虽然野生型的活性也有提升，但突变体的优势就很明显了。
这时，很自然的一个疑惑就是高活性的突变体是否有序列选择性？有没有可能突变体只是针对测试的那个靶标序列活性更高？为此，作者测试了更多的靶标序列，发现针对所有测试的序列，突变体的活性都比野生型更高。不仅如此，突变体在检测特异性方面（如单碱基差异）与野生型一致。
不仅检测序列上没有选择性，而且针对不同靶标序列，在模拟不同的检测条件下，突变体都表现出了卓越的检测性能。作者这里测试了SARS-CoV-2, Zika, Dengue, Ebola以及miRNA的合成靶标序列。
最后，作者肯定是用临床样本来检验RBD#3L/#4L的性能。这里，作者也上将这两个突变体Cas13a蛋白与电化学进行结合，选择了当时非常需要检测的新冠样本进行验证。作者分别用了合成的序列，灭活的病毒和真实样本，测试了突变体免扩增直检的LoD可达aM，而相比之下，野生型Cas13a的LoD高于10^4以上，灵敏度相差至少1万倍。利用#3L和#4L直接检测临床样本，以RT-qPCR结果为对照，发现11个阳性样本中，突变体可以免扩直检出大部分阳性样本9/11 (#3L), 10/11 (#4L)，其中#3L突变体未检出Ct值为32和34的两个阳性样本，而#4L则漏检了Ct值为34的样本。Anyway，这个灵敏度免扩增直检的灵敏度已经很好了。
这篇文章是CRISPR免扩增直检的另一思路，通过对Cas蛋白进行改造后提升检测灵敏度，以期实现免扩增的目的。有关免扩增的研究，分别有（1）增加crRNA数量；（2）与为体积结合（微液滴或微孔）；（3）与电化学等检测手段结合；（4）与一系列级联放大体系结合，在不扩增靶标序列的情况下提升检测灵敏度；（5）改造Cas蛋白，以及优化Cas的反式切割体系等。当然，很多体系也不是单一的改进，比方说，这里就包括了蛋白改造和电化学，但是本文的主要创新或者说主要贡献还是在蛋白改造部分。再比如opn-SATORI的工作，虽然也涉及到了新的LtrCas13a蛋白的挖掘工作，不过还是以微孔方面的工作为主。
1. 这篇工作比较重要，因为获得了两个比较有用的高活性突变体RBD#3L/#4L，对于后续的科研工作者，又多了两个可测试的工具。另外，这篇工作也提出了新的思路，通过提升Cas蛋白与target RNA的结合力（其实是非特异性结合力），来提升检测灵敏度。整体上，按照这个思路，其实Cas12a的活性也可以尝试进化，比方说，将一些DNA Binding Domain与Cas12a进行融合，包括一些SSB结合蛋白，来提升Cas12a与靶标DNA的（非）特异性结合力，从而提升Cas12a的检测灵敏度。这个方向值得一试，感兴趣的同学可以尝试一下（无任何理论和实验依据，只是假说，仅供参考）。另外，从补充材料中的图可以看出，这篇工作里用到的蛋白其实纯度也不太高，但是这一点也不影响发表NCB，所以说，还是得有创新的想法啊。
2. 作者在Fig.S5中测试了突变体的Km和Kcat，发现突变体主要是降低了大幅降低了Km值，这点与上面的逻辑是一致的。不过，鉴于之前关于Cas12a的Kcat以及催化活性等数值，不同研究团队之间的结果还是差异比较大的，感兴趣的同学可以去仔细研究一下。因此，Cas蛋白的酶活参数还是应该系统地测定一下。大家如果看到更多Cas13酶活结果的话，请帮忙私信我一下。当然，Cas蛋白的反应是一个三元复合物，涉及到Cas蛋白、crRNA和target序列；另外，不同的target序列之间，以及不同的reaction buffer之间都会影响实验结果。所以说，这本身也是一个比较复杂的事情，需要不同团队，较多的实验数据，才能比较客观地理解Cas蛋白反式切割的活性，亦即Cas切割引起的信号放大倍数/速率。
3. 作者这里改造的是LwaCas13a，我们之前介绍的opn-SATORI工作中，作者挖掘了LtrCas13a，其天然的活性要高于LwaCas13a，那么问题来了。如果用这篇工作的研究思路来改造LtrCas13a，获得类似的突变体，是否基于Ltr的突变体的活性会更高？有兴趣的同学可以去试一下。另外，这篇工作中，对于buffer的优化工作不多，如果再加入buffer优化的话，是否也可能再进一步提升检测灵敏度。
4. 感觉reporter的筛选还是值得更加深入地研究的，不管是对于野生型来说还是对于这里改造后的突变体来说，除了简单的长度参数外，序列的影响可能会更大。不过这得有较高效的筛选系统来完成，否则，各种组合是个天文数字，直接合成后测试的话，不太现实。欢迎大家一同交流好的筛选reporter序列的idea。
参考文献：
[1]. Yang J, Song Y, Deng X, Vanegas JA, You Z, Zhang Y, Weng Z, Avery L, Dieckhaus KD, Peddi A, Gao Y, Zhang Y, Gao X. Engineered LwaCas13a with enhanced collateral activity for nucleic acid detection. Nat Chem Biol. 2023 Jan;19(1):45-54. doi: 10.1038/s41589-022-01135-y. Epub 2022 Sep 22. PMID: 36138140.
