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CRISPR技术被越来越多的人所熟悉，想实现CRISPR的多重检测的难度较高，而实现一种Cas酶在同一反应体系中的多重更是一种新的挑战！我们一起来看看本文作者是如何实现这一检测方法的吧~
今天给大家分享的这篇文章题为“Multiplexed CRISPR-Based Nucleic Acid Detection Using a Single Cas Protein”，作者正是利用单一的Cas酶实现了多重检测。在这篇文献[1]中，作者提出了CRISPR-TMSD的概念，将toehold-mediated strand displacement（TMSD）和Cas12a的顺式剪切（cis-cleavage）进行整合，并通过使用靶点特异性的报告序列，实现单个Cas12a介导的多重检测。联合RPA预扩增，最低检测限可达1 copy / μL。为了验证方法的可实用性，作者对致癌基因EGFR和SARS-CoV-2常见突变进行了单核苷酸检测，在60 min内成功识别SNP。
在介绍文章内容之前，先熟悉一下TMSD的概念吧！双链DNA末端悬挂的一段粘性序列（Toehold）为反应的起始序列，Toehold可与目标分子杂交，进而发生链置换反应，这一过程称为Toehold介导的链置换反应[2]。在一个典型的TMSD中，入侵链（invader strand）与Toehold的结合引发了反应，通过分支迁移（branch migration）取代了当前链（incumbent strand）。TMSD是一种不依赖于酶的由DNA的生物物理学特性驱动的化学反应。与简单的Watson-Crick碱基配对相比，TMSD可以提高核酸识别的特异性。
作者构建的CRISPR-TMSD系统中（如图1），靶标先通过RPA或RT-RPA进行扩增，扩增产物由Cas12a顺式剪切并产生一个8 nt的悬垂结构，并称该链为offend strand（O链），O链与TMSD一条链（A链）中预先设计的支点区域互补，这种结合将有效地阻止TMSD反应中的链置换，预先设计的荧光/淬灭基团由于没有发生链置换反应而保持靠近，进而没有荧光信号产生（fluorescence off），这种状态称为“toehold-blocked TMSD”［TMSD(tb+)］。在没有O链存在的条件下，链置换发生（E链置换C链），导致荧光和淬灭基团分离，产生相应的荧光信号（fluorescence on），这种状态称为“TMSD(tb-)”。由于TMSD反应是独立发生的，因此该平台只需重新设计A链，使其具有一个支点区域，就能够与另一种具有不同8 nt悬垂的O链杂交，即可轻松检测另一靶点。通过针对不同待测靶标设计多个crRNA，CRISPR-TMSD利用Cas12a的特异性顺式剪切活性，产生多种8 nt悬垂的O链，引发不同荧光标记的TMSD反应，从而实现同一反应体系中的多重检测。
接下来，小编将重点围绕如何设计A链从而实现CRISPR-TMSD多重检测以及SNP位点检测展开分享。
作者在建立和优化系统之后，对EGFR突变体L858R、T790M和delE746-A750进行了检测（图2a）。首先，利用特殊设计的引物和crRNA, CRISPR/Cas12a系统可以剪切对应的PCR扩增产物并产生一个8 nt的悬垂，该悬垂在起始区域包含L858R突变（图2b1红色），或delE746-A750（图2b2紫色），或T790M（图2b3红色）。
图2.CRISPR-TMSD检测EGRF多重突变的设计
当对应的突变靶标存在时，Cas12a/crRNA复合物特异识别并剪切双链DNA产物，所产生的悬垂粘性末端通过碱基互补占据A链预留的Toehold区，无法启动TMSD，导致低荧光信号（背景信号）；当对应的靶标不存在时，Cas12a/crRNA复合物不能识别剪切，无对应的悬垂末端产生，导致E链结合到A链的Toehold区，触发TMSD反应，产生较强的荧光信号。因此，可以通过荧光信号值判断L858R、delE746-A750、T790M突变的存在和不存在（图3d）；值得注意的是，野生型EGRF靶点产生的荧光明显高于突变型靶点，表明CRISPR-TMSD具有一定的特异性（图3c）。ΔFU（ΔFU = F[TMSD (tb−)] − F[TMSD (tb+)]）数据显示，CRISPR-TMSD能够区分EGFR基因中的三种SNP类型。为了评估CRISPR-TMSD对低丰度突变的检测性能，作者采用不同比例的野生型/突变型（WT：MT）混合样本进行测试，结果表明，3种突变型均能在99%的背景浓度下成功检测到（图3e−g）。
图3.CRISPR-TMSD检测多重EGRF突变的结果
随后，作者采用三种商业化的EGFR突变细胞系(A549, H1975和H1650)对CRISPR-TMSD用于检测细胞样本中致癌基因的可行性进行了验证。A549细胞含有野生型EGFR基因；H1975细胞株EGFR基因存在L858R和T790M突变；H1650细胞株EGFR基因存在delE746-A750突变。实验结果显示，CRISPR-TMSD成功从细胞样本中检测出这些突变，ΔFU数据还表明，CRISPR-TMSD可以有效区分不同细胞系中的突变型和野生型靶点（图4b）。这些结果证明了CRISPR-TMSD检测人类细胞中特定SNP突变的可行性。
图4.CRISPR-TMSD检测细胞系中的多重EGRF突变
从理论上看，基于8 nt悬垂区和位点区域之间的碱基配对，TMSD可以在同一反应管中通过在G链上标记不同荧光团即可分开指示不同的靶标核酸存在或不存在，从而进行多重检测。CRISPR-TMSD报告探针具有靶点依赖性和Cas蛋白非依赖性，因此，分别针对EGFR基因的3种突变L858R、T790M和delE746-A750，在TMSD设计中分别使用FAM、ROX和HEX三种荧光基团标记G链，从而通过不同的荧光信号水平检测出不同的突变组合（图5）。
图5.针对3种EGRF突变的TMSD设计
图6.CRISPR-TMSD检测SARS-CoV-2及其变异株
参考文献：
[1] Fu, J., et al., Multiplexed CRISPR-Based Nucleic Acid Detection Using a Single Cas Protein. Analytical Chemistry, 2023. 95(44): p. 16089-16097.
[2] Bai, S., et al., High-Discrimination Factor Nanosensor Based on Tetrahedral DNA Nanostructures and Gold Nanoparticles for Detection of MiRNA-21 in Live Cells. Theranostics, 2018. 8(9): p. 2424-2434.
