今天学习一下关于Cas13蛋白的crRNA设计问题，是来自洛克菲勒大学Marraffini团队发表在MC上的一篇工作。Marraffini教授也是CRISPR领域的牛人，曾经早在2008年发表了一篇Science工作，证明了Type III-A的CRISPR系统靶向的是DNA序列，而不是RNA序列。Marraffini教授和张锋教授合作也比较多，也参与了张锋教授那篇Science成名作，是共同作者。
之所以选择这篇工作，是因为这篇工作的重要性。这篇文章解决了Cas13蛋白crRNA的设计中常碰到的一个问题，即如何选择高效的target序列（即protospacer序列，与crRNA的spacer序列互补配对）？
原文的数据比较多，实验对照非常详细，感兴趣的同学可以下载原文认真读一下。我这里就不一一解读原图了，直接来说下结论（Graphical Abstract中也能看的比较清楚）。
作者把crRNA茎环3’端8nt的DR区称为tag序列，与spacer序列相连。研究发现当target RNA含有anti-tag序列时，protospacer及anti-tag序列会与crRNA的spacer及tag序列以碱基互补配对的反式形成dsRNA结构，这种结构会将Cas13a锁定（LOCK）在被抑制的状态，这种抑制包括体内和体外，也包括cis和trans切割活性。而且，Cas13a在这种LOCK失活的状态下是无法被高浓度target RNA激活的。
这里，作者也解释了Cas13 anti-tag的进化意义，即可以防止CRISPR自切割。这个解释感觉上还是很有道理的。
这篇文章的工作对于我们设计Cas13 crRNA spacer序列时很有帮助。我们之前只知道关注target RNA的PFS序列，这篇MC则告诉我们其实应该关注anti-tag序列。
这里作者提到了对于LshCas13a来说，选择用PFS而不是PAM来定义3' protospacer序列，提到了PFS不能是G。当然，这里选择用PFS的原因，现在看来不一定成立，因为Marraffini的这篇文章中明确提出了anti-tag的意义可能在于区分自我和非我序列，和PAM其实是一致的。不过，名称不是最关键的，我们接着往下看。
在原文Figure 2中，作者做了PFS scanning的工作，其中发现当PFS位G时，Cas13的切割效率不高，而为C/A时普遍较高，U也还行。其实，这里仔细分析后，我们就能发现，有几个靶点，如26和28，刚好就满足了部分anti-tag序列的特征，都是GUUU序列。其他几个PFS=G的序列，虽然不能和tag形成完美的dsRNA，但是也是起到了anti-tag的作用？还是说有些序列的效率就是低，跟PFS没关系，因为在以C/A/U为PFS序列的情况下，各个crRNA的切割效率也是差异比较大的。那么，是否在张锋教授早期的实验数据中，其实就已经提示了anti-tag序列的存在？只是当时没意识到？欢迎大家整理更多的数据来一起讨论分析。
（2）第二篇是来自Jennifer Doudna团队同样于2016年发表于Nature的一篇工作。虽然这篇工作比张锋的那篇Science稍微几个月，不过这篇工作中倒是证明了Cas13具有trans-cleavage/collateral cleavage的活性。当然，该活性到底是谁先发现的，也不能完全看文章，也还得要去扒她们团队和张锋团队的专利申请时间和内容，以后有空再找资料分析吧。
在这篇Nature文章中，作者用LbuCas13a进行了PFS分析，最后发现该蛋白没有显著的PFS选择性，G/C/A/U都能切割的很好，这点应该是和这篇MC的结论是吻合的。
当然，后来杨辉教授团队鉴定了Cas13X.1后，发现Cas13X.1蛋白也没有显著的PFS序列选择性（下图）。
所以，综合分析，推测Cas13的PFS单点序列的影响比较小，而受anti-tag影响的可能性比较大。在张锋的那篇Science中，很可能也是个一个巧合？即在PFS=G的序列中，有几条不仅满足了G的要求，也满足了anti-tag的条件，剩余的可能就是spacer序列本身的效率就比较低，可能换啥PFS都效率低？
2. 感觉上这个anti-tag的发现可以用于multiplexed diagnostics诊断体系的设计。欢迎大家来一起思考，一起交流，我们找个时间再来一起讨论这个可能性。
参考文献：
[1] Meeske AJ, Marraffini LA. RNA Guide Complementarity Prevents Self-Targeting in Type VI CRISPR Systems. Mol Cell. 2018 Sep 6;71(5):791-801.e3. doi: 10.1016/j.molcel.2018.07.013. Epub 2018 Aug 16. PMID: 30122537; PMCID: PMC7955661.
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