作者首先提出了caged crRNA修饰失活及光照后激活的原理；摸索了不同修饰碱基数量的效果（从2个到6个npom修饰），光照的时间等条件，并且证明了caged crRNA（应该是在其被激活后）不影响CRISPR-Cas12a直接检测靶标DNA的灵敏度和特异性。
在此基础上，作者进而将CRISPR-Cas12a-caged crRNA与RPA体系相结合，开发了一步法CRISPR诊断体系。并且作者证明了光调控的一步法体系（c）比传统的一步法（d）要更加灵敏（摘要中显示是高50倍以上）。另外，用临床样本检测DNA病毒EBV时，传统的（e）的检出率要低于本工作中开发的新方法（f&g，不同光照时间）。
紧接着，作者又进一步检测了RNA病毒SARS-CoV-2，使用了临床样本和RT-RPA扩增方法。通过与RT-qPCR技术进行平行比较，作者证明了新方法具有非常高的特异性和灵敏度。而且，整个检测可以在10-20 min内完成，因而从速度上也是非常具有优势的。
这篇工作提出了不同的crRNA的block方法，通过NPOM修饰来失活crRNA及CRISPR-Cas12a反式切割活性，然后再通过光照来激活。相比于上一篇中提到的PC-oligo的方法，本篇工作中的修饰从封闭效果上来说，肯定是更好的，体系的重复性和实用性肯定也更好，但是，不知道成本上是否可以接受（其实量只要大了，成本应该都不是问题）。
1. NPOM修饰早期由北卡罗来纳州立大学Deiters教授团队开发的[2]，用来修饰DNA（DNAzyme），并通过光照进行活性调控（下图）。
后来JHU的Taekjip Ha教授等将NPOM修饰引入CRISPR-Cas9的sgRNA修饰和调控，开发了very fast CRISPR编辑系统，工作于2020年发表在Science杂志上，在当时受到了极大的关注，大家有兴趣的话，可以找下原文[3]阅读。
2. 光照和控温都是很好的调控手段，都可以通过设备很方便地实现。相比之下，如果是一步法（一管法）系统的话，在不开盖的情况，很难通过添加某种诱导剂来进行活性调控。现在已经有光照的方法来激活CRISPR诊断体系的很多篇工作了，但是，还没有控温的调控系统。像PCR体系，最终还是采用了在Taq酶上进行修饰（化学或者抗体），并用加热的方法来释放，操作上非常简单，成本也可控。对于CRISPR-Cas蛋白来说，是否可以筛选类似的抗体，比方说跟耐高温的Cas蛋白组合，在常温下封闭，在高温下（60-70℃）条件下释放；或者，能否找到合适的anti-CRISPR蛋白，与抗体的功能类似。大家有兴趣的话，可以去思考一下。目前还处于CRISPR诊断技术的快速优化期，只要有些创新亮点，都是很重要的工作，当然也会得到很大程度的认可，不管是在论文上还是专利上或者将来的产业化应用层面。
3. NPOM修饰，貌似国内能做的公司比较少，但是，这种修饰还是很值得关注的。只要仔细思考，这种修饰其实在很多方面都可以应用（不只是CRISPR领域）。大家如果能够找到国内能够修饰NPOM的公司，可以多投入点精力调研，并尝试加入到自己的课题中。否则，如果都在美国合成的话，再运到国内，价格和周期都是个挑战。
4. 除了NPOM修饰，北京大学汤新景教授团队也曾开发了用维生素E来封闭的Cas9 sgRNA，同样用光照激活（PMID: 33448579）。理论上，这种修饰或者类似的修饰/调控都可以用于CRISPR诊断。大家可以多去找一找类似的修饰调控，特别是不同的修饰和调控，能否组合起来，做成CRISPR诊断多重？这个方向也值得关注。
参考文献：
[1] Hu M, Liu R, Qiu Z, Cao F, Tian T, Lu Y, Jiang Y, Zhou X. Light-Start CRISPR-Cas12a Reaction with Caged crRNA Enables Rapid and Sensitive Nucleic Acid Detection. Angew Chem Int Ed Engl. 2023 Jun 5;62(23):e202300663. doi: 10.1002/anie.202300663. Epub 2023 Apr 27. PMID: 37016515.
[2] Lusic H, Young DD, Lively MO, Deiters A. Photochemical DNA activation. Org Lett. 2007 May 10;9(10):1903-6. doi: 10.1021/ol070455u. Epub 2007 Apr 21. PMID: 17447773; PMCID: PMC2532984.
[3] Liu Y, Zou RS, He S, Nihongaki Y, Li X, Razavi S, Wu B, Ha T. Very fast CRISPR on demand. Science. 2020 Jun 12;368(6496):1265-1269. doi: 10.1126/science.aay8204. PMID: 32527834; PMCID: PMC7608738.
