作者首先介绍了3种RNA的修饰方式，包括在crRNA的5'端，中间和3'端；并且利用了Cas12a反式切割活性来研究Cas12a on-target和off-target的情况。其中crRNA靶向的是用HBV-B序列，而测试脱靶实验则使用了HBV-C序列，这里的-B和-C序列有两个碱基差异。
接着，作者又测试了不同修饰的吉布斯自由能的变化，最后发现5'-和3'-修饰的crRNA都能提升Cas12a对靶标序列的亲和力，而只有在3'-端进行2'-OMe修饰的crRNA才能显著抑制Cas12a对non-target序列的亲和力（即特异性高）。
在上述发现的基础上，作者进一步测试了Cas12a在不同修饰crRNA引导下区分SNP的能力差异，其中包括target-11th和target-19th两个靶标，分别代表SNP位于第11和19两个位置。作者发现，所有位置修饰的crRNA都能提升Cas12a的特异性，但是只有中间和3'-端修饰的crRNA提升的效果最好（上图D的target-11是3'端修饰的效果最好，而-19th则是m修饰的效果最好）。
此外，作者还用修饰的crRNA体系来检测SARS-CoV-2序列，并用来区分不同的突变株，最后发现实验结果与之前的一致，即3'端修饰的crRNA能够带来更特异的区分效果，可以有效区分D614G突变株。
这篇工作中作者通过研究crRNA的修饰，找到了一种提升Cas12a识别靶标序列的修饰方法，从而为CRISPR诊断的研究提供了宝贵的知识储备。之前应该还有不少工作是做CRISPR RNA的修饰研究的，不仅包括CRISPR诊断，也包括CRISPR基因编辑相关。感觉上，CRISPR诊断和编辑，在crRNA的研究上，很多时候都是相通的。因此，这篇工作中发现的修饰是否可以应用于Cas12a的基因编辑研究？
参考文献：
[1] Ke Y, Ghalandari B, Huang S, Li S, Huang C, Zhi X, Cui D, Ding X. 2'-O-Methyl modified guide RNA promotes the single nucleotide polymorphism (SNP) discrimination ability of CRISPR-Cas12a systems. Chem Sci. 2022 Feb 1;13(7):2050-2061. doi: 10.1039/d1sc06832f. PMID: 35308857; PMCID: PMC8848812.
[2] Basila M, Kelley ML, Smith AVB. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 2017 Nov 27;12(11):e0188593. doi: 10.1371/journal.pone.0188593. PMID: 29176845; PMCID: PMC5703482.
