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细胞内异常的NAD+含量变化与许多代谢相关疾病的发生发展相关，对其精准定量检测对于疾病的预防具有重要的意义。那么如何利用CRISPR技术实现对细胞内NAD+进行检测呢？带着这个问题，随小编一起来看看下面的文章吧~
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是细胞分解代谢中不可或缺的元素，它不仅作为氧化还原反应中的辅酶参与反应，还是去乙酰化酶家族sirtuin蛋白和PARP家族DNA修复酶在内的NAD+依赖性酶的重要共底物。因此，量化检测NAD+水平有助于反映生物体的状态，并可能预防与代谢相关疾病的发生和进展。迄今为止，多种检测NAD+的技术已被开发出来，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/电喷雾电离串联质谱法（MS）、酶学测定法以及基因编码的荧光蛋白生物传感器。然而，这些技术要么耗时长，要么需要大型昂贵的仪器，带来许多不便。例如，HPLC方法的灵敏度较低，与其他技术相比需要更多的样本。虽然MS方法具有高精度和高特异性，但它依赖于昂贵的精密仪器和专业操作。酶学方法，也被称为比色NAD+测定法，需要两步来计算NAD+的量。首先，测量NAD+和NADH的总量以及NADH的量，然后通过减法间接获得NAD+浓度。尽管基因编码的荧光蛋白生物传感器在灵敏度、快速性和便利性方面显示出优势，但其特异性需要进一步提高，因为它难以区分低浓度的NAD+和高浓度的NADH样本。因此，有必要开发一种快速、可靠、经济、定量的NAD+检测新方法。
针对于此，深圳市第二人民医院和上海吐露港研究团队，共同开发了一种基于CRISPR/Cas12a的新型NAD+检测方法，命名为HOLMES(NAD+)，可实现对NAD+快速、可靠和经济的定量检测。
HOLMES(NAD+)系统包括乙酰化的Cas12a、CobB、crRNA、目标双链DNA（dsDNA）以及单链DNA-FQ报告探针。由于乙酰化的Cas12a失去反式切割活性，单链DNA-FQ报告探针不会被乙酰化的Cas12a切割，因此无法检测到荧光信号。只有NAD+存在的情况下，去乙酰化酶CobB对乙酰化Cas12a进行去乙酰化，恢复其反式切割活性，切割单链DNA-FQ报告探针并产生荧光信号。由于NAD+浓度与HOLMES(NAD+)中的荧光信号之间呈正相关，因此HOLMES(NAD+)可应用于NAD+检测。
初步建立HOLMES(NAD+)检测体系后，作者分别对该体系可检测的NAD+浓度范围、最低检测浓度、特异性等方面进行研究。实验表明，在NAD+浓度从7.8 nM到1000 nM之间，随着NAD+浓度的增加，HOLMES(NAD+)产生的荧光信号逐步增强，相关系数R2=0.997。经计算，HOLMES(NAD+)可检测NAD+的最低浓度为22.5 nM。特异性分析表明，HOLMES(NAD+)只可检测NAD+，不能检测NADH、NADP+、NADPH、AMP、ADP、ATP、NMN小分子，表明HOLMES(NAD+)具有高特异性。
除了检测纯NAD+溶液外，作者还研究HOLMES(NAD+)用于真实生物样本中NAD+含量的检测。实验表明，使用HOLMES(NAD+)方法，检测出的细胞NAD+水平大约为200-600 pmol/106细胞，其结果与MS和MTT方法的结果一致。此外，HOLMES(NAD+)可进一步用于定量检测97H、HeLa和HCT116细胞内NAD+浓度的变化，在用FK866（一种烟酰胺磷酸核糖转移酶的抑制剂）处理后，所有测试细胞系中的细胞NAD+水平都发生显著下降，这与先前的报道一致。
图3. HOLMES(NAD+)体系检测实际样本
参考文献：
[1] Zhuang S, Hu T, Zhou H, He S, Li J, Zhang Y, Gu D, Xu Y, Chen Y and Wang J (2024), CRISPR-HOLMES-based NAD+ detection. Front. Bioeng. Biotechnol. 12:1355640. doi: 10.3389/fbioe.2024.1355640
