《J. Agric. Food Chem》计算机辅助理性设计策略提高褐藻胶裂解酶AlyMc的热稳定性

2024年1月，上海海洋大学的Yongyan Cui等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Computer-Aided Rational Design Strategy to Improve the Thermal Stability of Alginate Lyase AlyMc的研究性论文。

褐藻胶寡糖（AOS）是一种功能性低聚糖，是褐藻胶的降解产物，聚合度（DP）为2−10。AOS的特点是粘度降低、溶解度增强、生物活性优异。AOS具有多种生物活性，被广泛应用于食品、医药、饲料等领域。褐藻胶裂解酶通过β-消除机理降解褐藻胶，在非还原端C4和C5之间形成双键，其降解产物为不饱和褐藻胶寡糖(UAOS)。值得注意的是，与AOS相比，UAOS具有更好的生物活性，例如降血脂和免疫调节。褐藻胶裂解酶主要来自海藻、海洋软体动物以及各种海洋和陆地细菌、真菌和病毒。根据CAZy数据库分类，褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(PL)家族，其子分类包括PL-5、PL-6、PL-7、PL-8、PL-14、PL-15、PL17、PL-18、PL-31、PL-32、PL-34、PL-36、PL-39和PL-41家族。根据底物偏好性，褐藻胶裂解酶可分为三类：PM特异性褐藻胶裂解酶（EC4.2.2.3），PG特异性褐藻胶裂解酶（EC4.2.2.11）和双功能褐藻胶裂解酶（EC4.2.2.-）。根据作用方式的不同，褐藻胶裂解酶可分为内切型褐藻胶裂解酶和外切型褐藻胶裂解酶两类。内切型褐藻胶裂解酶可裂解褐藻胶分子内部的糖苷键，生成UAOS，DP为2-5，外切型褐藻胶裂解酶仅从褐藻胶分子的非还原端逐渐产生单糖或双糖。根据褐藻胶裂解酶的结构特征可分为四类：(1)β-果冻卷折叠(PL-7、PL-14、PL-18、PL-36家族)。（2）β-螺旋折叠结构（PL-6和PL-31家族）。（3）(α/α)n环状折叠。（4）(α/α)n环面+β-果冻卷折叠（PL-15、PL-17和PL-39）家族。更重要的是，某些具有独特特异性的褐藻胶裂解酶可用于定向制备具有特定单糖组成和聚合度的AOS。

影响蛋白质稳定性的因素很多，包括氨基酸组成、二硫键、疏水相互作用、氢键、盐桥、静电力、芳香相互作用等。蛋白质工程策略，包括定向进化、半理性设计和理性设计，已成为提高酶热稳定性的有力工具。其中，理性设计方法成为提高酶热稳定性的关键。例如，Wang通过ΔΔG评估提高了Rhizopus chinensis脂肪酶的热稳定性，Zhou通过序列、结构、ΔΔG值分析等综合策略提高了褐藻胶裂解酶PMD的热稳定性。蛋白质的热动力学稳定性用折叠自由能(ΔG)来评价，野生型与其突变体之间的折叠自由能之差表示为突变效应。在另一项研究中，Yang通过引入二硫键成功提高了褐藻胶裂解酶cAlyM的热稳定性。二硫键可以通过降低未折叠蛋白质的熵来增加酶的结构刚性和热稳定性。

AlyMc是一种PL-7家族褐藻胶裂解酶，由Microbulbifer sp.Q7获得，具有polyG特异性，其基因在大肠杆菌中克隆。本研究采用HotSpot Wizard 3.0与PoPMuSiC相结合的理性设计方法来提高AlyMc的热稳定性。为了研究热稳定性的分子机制，进行了结构分析和分子动力学（MD）模拟。本文采用的综合理性设计方法可以为提高酶的热稳定性提供一种途径。

1.突变位点选择和突变表达

为了提高AlyMc的热稳定性同时保持其酶活性，我们采用了理性蛋白质策略。B因子和ΔΔG是评价蛋白质稳定性的重要参数，蛋白质中氨基酸的B因子值越高，该氨基酸对蛋白质稳定性的贡献就越小。ΔΔG的负值表明突变氨基酸对蛋白质的热稳定性有积极的影响。AlyMc的三维结构被提交给HotSpot Wizard 3.0和PoPMuSiC网络服务器来预测突变位点。根据B因子（> 22）和ΔΔG（<0）的值筛选突变位点。此外，我们还考虑了催化位点和活性中心附近的氨基酸对酶活性的影响，因此去除了催化位点5Å范围内的突变位点。最终，选出突变体K249P、K249V、Q246V、R84N、I170V、G166A、N149M、N149E、A106P、E110D、K159Q和Q246L，并通过定点诱变构建。这些突变位点在酶的三维结构中的位置如图1所示。

褐藻胶裂解酶AlyMc及其突变体表现出可检测的细胞外酶和细胞内酶的酶活性。AlyMc及其突变体（Q246V、Q246L、K249V、K249P、G166A、I170V、K159Q、N149M、N149E、E110D、A106P和R84N）的胞外和胞内酶活性如表1所示。与AlyMc相比，大多数突变体表现出酶活性降低；值得一提的是，所有突变体都保留了至少80％的酶活性。具体来说，突变体Q246V、K249V、Q246L、I170V和R84N维持90%以上的酶活性，只有三个突变体（N149E、K159Q和N149M）表现出超过100%的活性。

图1.AlyMc的三维(3D)模型和突变位点的位置(R84、A106、E110、N149、K159、G166、I170、Q246和K249)。使用PyMOL 2.5.3软件进行三维分子可视化，AlyMc模型中绿色氨基酸表示突变位点，箭头指向其放大结构。

表1. AlyMc及其突变体的相对酶活性。

2.最佳温度和pH值

如图2A所示，AlyMc的最适温度为50 ℃；突变体Q246L为40℃；突变体K249P、K249V、Q246V、I170V为45℃；突变体G166A、N149M、N149E、A106P、E110D、K159Q与AlyMc一致。除K249P、I170V和E110D外，所有突变体都有与AlyMc相同的最佳pH值(pH 7.0)。然而，突变体K249P、I170V和E110D的最佳pH值为7.5（图2B）。值得注意的是，PL-7家族的最佳温度范围和最佳pH范围分别为30−55℃和7.0−9.0。然而，有些褐藻胶裂解酶表现出特殊的特性。例如rAly1和rAly5在pH 6.0时表现出最大活性，而Alyw208和AlgH在pH 10.0时表现出最大活性。AlyMc及其突变体的最适温度和pH分别在30−55°C和7.0−9.0的范围内。

图2.温度和pH对AlyMc及其突变体活性的影响。（A）AlyMc及其突变体的最适温度。（B）AlyMc及其突变体的最适pH。

3.AlyMc及其突变体的热稳定性

为了研究AlyMc及其突变体的热稳定性，首先将酶在45℃下孵育1、2、3和6小时（图3A）。结果表明，AlyMc、Q246L、Q246V、K249P、K249V在45℃下孵育6h后酶活性均达到70%以上。然而，突变体N149E、K159Q、I170V、R84N和N149M表现出的酶活性几乎低于10％。突变体G166A、A106P和E110D在3小时后仍保持低于15％的活性。根据这些结果，选取四个热稳定性较高的突变体（Q246V、Q246L、K249V、K249P）进行后续实验。采用His-tag蛋白纯化磁珠对AlyMc 及其四种突变体进行纯化，表S3展示了褐藻胶裂解酶AlyMc及其突变体的纯化酶浓度。如图S1所示，四个突变体均以相同的分子量成功表达，这与褐藻胶裂解酶AlyMc一致。突变体Q249V的蛋白表达量最好，Q246V的蛋白表达量略高于AlyMc，突变体Q246L和K249P的蛋白表达量低于AlyMc。

如图3B所示，与AlyMc相比，突变体Q246L、Q246V、K249P和K249V表现出了显著的热稳定性。在50℃下孵育3小时后，突变体Q246V、Q246L、K249V和K249P均保留了60%以上的酶活性，而WT则降至50%以下。WT的半衰期（t1/2，50℃）为2.36h，突变体Q246L、Q246V、K249P、K249V的t1/2、50℃值分别为2.89、3.85、2.69、3.65h（表2）。在55℃时，WT和其突变体酶活性明显下降(图3C)，AlyMc在孵育1h后仍维持不到30%的酶活性。然而，突变体Q246V、K249V和K249P保留了超过50%的活性。

图3.褐藻胶裂解酶AlyMc及其突变体的热稳定性能。(A)AlyMc及其突变体在45℃下的热稳定性。(B)AlyMc及其突变体在50℃下的热稳定性。(C)AlyMc及其突变体在55℃下的热稳定性。通过测量在45、50和55℃下孵育6小时后酶的残留褐藻胶裂解酶活性来研究AlyMc及其突变体的热稳定性。

表2. AlyMc及其突变体的特征。

4.结构分析

蛋白质表面带电的氨基酸可以通过电荷间的相互作用，形成保护网络，防止蛋白质变性和沉淀，增加对高温的抵抗力。重新设计和优化蛋白质表面静电荷的分布可以提高蛋白质的热稳定性。利用PyMOL分析蛋白质表面静电荷的变化。如图4A所示，AlyMc的Gln246处的静电荷与周围的电荷分布不一致，对整体稳定性产生了相当大的负面贡献。此外，残基Val246位于突变体Q246V的中性电势区域，与周围的电荷分布一致（图4B）。突变体K249V（图4C）对热稳定性的积极影响可能归因于通过添加羧基引起的表面静电荷的重新分布。因此，突变体表面静电荷的有利变化增强了AlyMc的热稳定性。

此外，DynaMut用于检查分子内相互作用，它为AlyMc及其突变体的结构生成PyMOL会话，以帮助可视化和图形制作。与AlyMc相比，突变体K249V中与Glu77连接的一个天然氢键丢失，而突变体K249V显示出Gln144，Val249和Glu77之间的疏水相互作用增加。此外，在突变体K249V中观察到Glu77和Leu78之间三个新形成的极性键（图5A、B）。如图5D所示，与AlyMc相比，突变体Q246V中氢键的数量显然没有变化。然而，突变体Q246V表现出Val246和Trp99之间更强的疏水相互作用。此外，Val246和Ile145之间新的疏水相互作用增强了（图5C，D）。

利用ProteinTools分析了AlyMc及其突变体的氢键网络、盐桥和疏水簇。表S4显示了AlyMc与其突变体之间氢键网络、盐桥和疏水簇的变化。AlyMc及其突变体(Q246V和K249V)中氢键网络数量分别为41、43和40。与AlyMc相比，Q246V和K249V中的盐桥和疏水簇的数量保持不变。

5.MD模拟分析

为了评估突变体Q246V和K249V的结构稳定性，对WT及其突变体在300K下进行了50ns的MD模拟。均方根偏差（RMSD）揭示了模拟过程中蛋白质构象与初始构象之间的位置变化，蛋白质的热稳定性与RMSD值呈负相关，而与刚性呈正相关。RMSD值越低，表明酶结构的初始构象保存得越好，表明热稳定性越高。如图6A所示，RMSD值显示AlyMc未达到平衡，而突变体Q246V在10.0ns后达到平衡，突变体K249V在15ns后趋于平衡。300K时AlyMc的平均RMSD值为1.415Å，而Q246V的平均RMSD值为1.097Å。突变体Q246V在0-50ns内处理的平均RMSD值低于AlyMc，表明突变体Q246V在300K时比AlyMc更坚硬，具有更好的热稳定性。

均方根波动（RMSF）表征整个模拟过程中蛋白质中每个氨基酸移动的灵活性和强度。RMSF分析（图6B）表明，AlyMc的残基1-2、176-178和188-192的RMSF超过2Å，具有高度的灵活性。与AlyMc相比，突变体的残基176−178和188−192具有较低的RMSF值。具体来说，AlyMc和Q246V的RMSF值分别为0.752和0.644Å。人们普遍认为，较低的RMSF值表示特定区域的灵活性较低，这将极大地影响其热稳定性。总之，突变体Q246V具有比褐藻胶裂解酶AlyMc更刚性和更稳定的蛋白质结构。

6.降解产物分析

为了分析AlyMc及其突变体的产物组成，采用薄层色谱法和高效液相色谱法对降解产物进行分析。首先对降解产物进行不同时间间隔的薄层色谱分析。图7A表明，AlyMc在褐藻胶降解过程中主要产生DP为2-5的寡糖。酶水解过程中，5和30分钟时主要产物为三糖和四糖。随着该过程的继续，双糖逐渐积累。相同反应条件下，突变体Q246V和K249V降解褐藻胶的产物分布如图7B，C所示。值得注意的是，这些突变体的产品特性与AlyMc相似，表明最终产品分布没有发生显著改变。

此外，通过HPLC监测最终产品的分布，结果显示在图S2中。如图S2A-C所示，HPLC对AlyMc及其突变体（Q246V和K249V）的产物分离显示，在21.5、23.0、24.7和27.4分钟的保留时间出现峰值，分别代表DP5、DP4、DP3和DP2。AlyMc降解褐藻胶的最终产物是DP为2-5的UAOS，其中四糖（36.53%）最为丰富。突变体Q246V降解褐藻胶的最终产物为二糖（30.25%）、三糖（25.78%）、四糖（33.98%）和五糖（9.99%）。此外，突变体K249V降解褐藻胶的最终产物为二糖（30.27%）、三糖（25.99%）、四糖（34.92%）和五糖（8.82%）。AlyMc及其突变体降解褐藻胶的最终产物为DP为2−5的UAOS，表明褐藻胶裂解酶AlyMc及其突变体（Q246V和K249V）为内切型褐藻胶裂解酶。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c07215