《Food Chemistry》构建并鉴定具有内切和外切裂解活性的新型融合褐藻胶裂解酶，用于工业制备褐藻胶寡糖
文摘
科学
2024-06-28 20:49
江苏
2024年6月，来自西南大学的Qing Guo等人在 Food Chemistry上发表了一篇题为Construction and characterization of a novel fusion alginate lyase with endolytic and exolytic cleavage activity for industrial preparation of alginate oligosaccharides的研究性文章。
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通讯单位：College of Food Science, Southwest University, No. 2 Tiansheng Road, Chongqing 400715, China.
Abstract
褐藻胶寡糖(AOS)的制备缺乏活性高、热稳定性好的褐藻胶裂解酶。构建了具有内外活性的融合褐藻胶裂解酶。通过将高度耐热的AlyRm6A与新的外切型裂解酶AlyZu7连接，成功构建了AlyRm6A-Zu7。该融合酶具有较高的催化活性和热稳定性。它将褐藻胶转化为聚合度为2-4的寡糖，同时生成4-脱氧-L-赤潮-5-己糖糖醛酸(DEH)。最高还原糖、AOS和DP1+DEH得率分别为75%、45%和40%。分子对接证实了底物与AlyRm6A-Zu7之间形成了稳定的络合物。蛋白质相互作用提高了AlyZu7的热稳定性。这项工作为利用热稳定的融合酶工业化生产AOS和单糖DEH提供了新的见解，在功能性寡糖生产和生物燃料形成领域具有积极的作用。
褐藻胶是一种来自某些藻类和细菌的阴离子多糖，在棕色大型藻类的组成中发挥着重要作用，约占其干重的40%。在结构上，褐藻胶由α-甘露糖酸(G)和β-D-甘露糖酸(M)单元通过1，4-糖苷键相连，形成聚α-L-甘露糖酸(Poly G)、聚β-D-甘露糖酸酯(Poly M)和杂多聚合物(Poly MG)。嵌段长度和类型的变化会影响聚合物的灵活性，从而影响溶液的粘度、凝胶性质、稳定性和渗透性。此外，它显示出生产褐藻胶寡糖(AOS)和用作生产生物乙醇的碳源的潜力。褐藻胶因其在生物燃料开发和多方面的生化用途方面的潜力而引起人们的关注。然而，由于它们的高分子量、不溶于水和有限的生物利用度，阻碍了它们的利用，因此仍然存在挑战。通过有效地将高分子组分降解为低分子组分或寡糖来提高褐藻胶的生物利用度，对于褐藻胶的广泛应用至关重要，特别是在医学上。褐藻胶的分解导致AOS的产生，AOS是由2-25个单体单元组成的链。这些寡糖可以通过各种降解方法获得，包括物理、化学和酶技术。该物理方法具有反应速度快、环境友好等优点。然而，它的缺点是成本高，降解效率有限。尽管化学方法具有成本效益且易于操作，但它们存在产生有毒物质降解产品、腐蚀仪器、造成环境污染的的风险。相比之下，酶解法制备AOS具有底物选择专一性强、反应条件温和、反应效率高、可控性强等优点。与物理法和化学法相比，酶解法是一种理想的、环境友好的方法，是制备AOS最常用的方法。AOS具有广泛的生物学特性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗菌活性，以及神经保护作用。它们在缓解高血压、降低血脂水平、对抗肥胖和调节血糖水平方面的潜力进一步放大了它们的价值。这些多方面的特性使AOS在食品、农业和制药行业中非常受欢迎，并被用作增强肠道健康的益生素、增强植物和微生物防御机制的激发子、在低温下保护细胞和组织的冷冻保护剂，以及具有抗病毒和抗癌特性的预防和治疗疾病的制剂。这种多功能性强调了AOS在促进健康、农业生产力和疾病管理方面的潜力。AOS的降解方式、相对分子质量、古罗糖醛酸(G)含量(G/M比)和AOS的空间构象对其生物活性有显著影响。聚合度(DP)的变化有明显的影响；聚合度为3-6的AOS诱导细胞因子合成并调节血糖和血脂，而聚合度为2-10的AOS抑制人前列腺癌细胞生长。将高相对分子质量的褐藻胶转化为低相对分子质量的AOS是回收利用褐藻胶生产生物燃料的关键一步。
褐藻胶裂解酶主要由细菌和真菌产生，对褐藻胶的降解是必不可少的。菌株UMI-01，成功克隆并表达了某些裂解酶基因。这个解聚过程产生不饱和寡糖，这些不饱和寡糖最终通过非酶反应转化为4-脱氧-L-赤藓-5-己糖糖醛酸。这种最终产品在生产生物乙醇和其他化学品的生物精炼系统中具有实用价值。因此，褐藻胶裂解酶的效率在释放褐藻生产生物乙醇和其他化合物的潜力方面起着至关重要的作用。褐藻胶裂解酶是糖化作用的重要催化剂，对褐藻胶的有效转化起着重要作用。这些酶既可以作为内切酶，也可以作为外切裂解酶。内切裂解酶随机地裂解糖苷键，释放不饱和的寡糖，而外切裂解酶通过切断糖苷键释放单糖来进一步分解这些由内切裂解酶产生的寡糖。褐藻胶裂解酶表现出特异性，分为poly M专一性、多G专一性或双功能裂解酶。根据氨基酸序列，在CAZy数据库(http://www.cazy.org/))中，鉴定的褐藻胶裂解酶属于不同的家族(PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41)。尽管褐藻胶裂解酶具有广泛的特性，但对外切裂解酶的鉴定仍然有限，大多数属于PL15和PL17家族。目前，大多数已鉴定的褐藻胶裂解酶以其内切活性为特征，而外切酶和双功能酶相对较少。研究主要集中于将褐藻胶裂解酶分类为褐藻胶内切酶或褐藻胶外切酶，对同时具有这两种功能的酶的研究相对有限。
“融合酶”的设计是通过将目标酶与其他酶、蛋白质或多肽以特定的排列合并来结合多种功能，从而增强酶的活性。然而，蛋白质的直接融合有时会降低它们的功能或阻碍它们的表达。因此，为了解决这一问题，人们开发了分离酶结构域、防止干扰并确保有效表达和活性的连接子。这种方法对分解木质纤维生物质和其他多糖特别有用，已成为酶研究的支柱。例如，Lu等人开发了一种融合了葡聚糖酶和木聚糖酶的酶，该酶同时具有葡聚糖酶和木聚糖酶的活性。与单独的酶表达相比，葡聚糖酶的催化效率提高了3.15倍，而木聚糖酶的催化效率降低了31%(kcat/kM)。通过优化两个结构域之间的连接肽，他们观察到催化效率显著提高。具体地说，(GGGGS)2连接子的使用导致了融合酶的葡聚糖酶和木聚糖酶活性，与单独酶的活性相比，分别提高了326%和43%。褐藻的有效糖化依赖于内切酶和外切酶的协同作用。然而，解离褐藻胶裂解酶的活性有限是工业规模化的主要障碍。因此，寻找酶效率高、功能齐全的褐藻胶裂解酶对褐藻糖化和广泛利用具有重要意义。
AlyZu7基因全长1050个核苷酸，编码349个氨基酸组成的蛋白质。值得注意的是，SignalP5.0分析显示AlyZu7的N-末端存在一个17个氨基酸的信号肽。该蛋白包含一个褐藻胶_Lyase2超家族结构域，特别是Glu47至Gly342(图1A)。该蛋白等电点为4.97，分子量约为35.28 kDa，稳定指数为26.70。在用不同PL7亚家族的褐藻胶裂解酶构建的系统发育树中，AlyZu7被归入亚家族5，如图1B所示。序列比对表明该蛋白存在一个催化基序(QIH)，并突出了关键残基Gln145、His147和Tyr297，这些残基在结构上具有特征的PL7褐藻胶裂解酶中是保守的。如图1C所示，这些残基在所有特征的PL-7褐藻胶裂解酶中都是显著保守的。
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图1.(A)AlyZu7的保守结构域。(B)AlyZu7和其他PL7褐藻胶解酶的系统发育分析。对应的多糖裂解酶序列的登录号伴随着物种名称。分支点显示1000次试验的引导值。分支相关数字是代表每个氨基酸残基的取代频率的自举值(置信限)。以褐藻裂解酶(WP_038232733.1)为对照。每个核苷酸位置有0.2个替换。子族1、3、4和5分别用蓝星、黄点、红色三角形和绿色正方形表示。(C)AlyZu7和其他PL-7褐藻胶裂解酶的多序列比对分析，催化部位用绿色三角形标记。
2.AlyZu7和AlyRm6A-Zu7的生化特性克隆了完整的AlyZu7基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。AlyZu7‘S的理论相对分子质量为35.28 kDa，二聚体为70.55 kDa。值得注意的是，SDS-PAGE观察到的约40和70 kDa的条带与预期的重量密切一致。此外，利用重叠聚合酶链式反应构建了AlyRm6A-Zu7融合基因，得到了一条约2.7kb的清晰条带。AlyRm6A-Zu7融合蛋白的理论相对分子质量为99.46 kDa。对AlyZu7和AlyRm6A-Zu7的生化性质进行了深入的研究。两种酶都以褐藻胶为底物，AlyZu7的最适反应温度为25℃，AlyRm6A-Zu7的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为7.0(图2A，B)。此外，AlyZu7和AlyRm6A-Zu7的酶活分别为53.0 6±2.0 2和301.15±1.16U/mg。此前，AlyRm6A的最适温度为50℃，最适pH为7，其比活性为89.23±1.14U/mg。与AlyRm6A和AlyZu7相比，AlyRm6A-Zu7具有更好的活性。![]()
图2.AlyZu7和AlyRm6A-Zu7的生化特性：(A)最适温度；(B)最适pH；(C)热稳定性；(D)底物专一性；(E)金属离子和化学物质的影响。
在热稳定性方面，AlyZu7在20-30℃孵育1h后仍保持其初始活性，但随着温度的升高，酶活性逐渐下降，在35℃和40℃下分别保持了约80%和60%的活性。在60-80℃孵育1h后，AlyZu7的活性显著下降，降至20%以下。同样，AlyRm6A-Zu7在30-50℃孵育1 h后保持了约90%的活性，在55℃下保持了约80%的活性，但超过55℃后，酶活性显著下降，在70℃孵育后活性较低，在80-90℃孵育后活性不到20%(图2C)。相比之下，AlyRm6A的活性在55℃开始下降，但在65℃保持了60%以上的活性。然而，在70℃，活性下降到约40%。同样，与AlyRm6A和AlyZu7相比，AlyRm6A-Zu7表现出较差的热稳定性。同时具有内切和外切活性的褐藻胶裂解酶的研究仍处于起步阶段。表S2提供了显示双重活性的褐藻胶裂解酶的摘要。通常，这些酶在温和的温度条件下表现最好，通常在30到40℃之间，最适pH约为7。这些酶中的许多与冷适应酶有共同的特征，在较低的温度下表现出更高的催化效率，但随着温度的升高活性显著下降，导致热稳定性有限。相比之下，融合酶AlyRm6A-Zu7表现出显著的热稳定性。经1h孵育后，其活力仍保持在在30~55℃的温度范围内80%以上，在65℃下保持了约50%的活性。由于其优异的热稳定性和内外结合的活性，AlyRm6A-ZU7已成为一种非常有前途的工业用酶，特别是在生产酸性磷酸酶或有价值的化合物DEH方面。在底物特异性研究中，与褐藻胶相比，AlyZu7对poly M和poly G片段的相对活性分别为53.39%和180.73%。AlyRm6A-Zu7对poly M和poly G的相对活性分别为49.79%和136.24%。这表明AlyZu7和AlyRm6A-Zu7都是poly G专一性的褐藻胶裂解酶，对Poly M的活性较低，但对褐藻胶的活性中等(图2D)。考察了不同金属离子和化学物质对AlyZu7和AlyRm6A-Zu7活性的影响。结果表明，Na+对AlyZu7的活性影响不大，而K+、Fe2+、Mg2+、Ba2+和Mn2+等离子对AlyZu7的活性有轻微的增强作用。值得注意的是，Li+和Ca2+使AlyZu7活性分别提高了80%和70%以上。相反，Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Al3+、Cr3+、Fe3+、十二烷基硫酸钠和Na2EDTA对酶活性有抑制作用(图2e)。同样，对于AlyRm6A-Zu7，Na+、K+、Mn2+和Mg2+对酶活性几乎没有影响，而Fe2+、Ba2+和Ca2+对酶活性有轻微的促进作用。Li+对酶活性有正向影响。但Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Al3+、Cr3+、Fe3+、十二烷基硫酸钠和Na2EDTA对其不利(图2F)。值得注意的是，AlyZu7对多种金属离子表现出比AlyRm6A-Zu7更大的耐受性，突出了其对不同金属离子条件的更广泛的适应性。为了验证融合酶AlyZu7的活性，我们对三种底物进行了详细的实验，并用TLC对反应产物进行了分析。结果表明，AlyZu7由褐藻胶、poly G和poly M产生单一糖型，不产生任何AOS，证实了其裂解机理(图S3)。此外，与褐藻胶钠相比，AlyZu7对poly M的活性为53.39%，对poly G段的活性为180.73%，突出了其对poly G底物的偏好。褐藻胶裂解酶的底物专一性是其在生物技术应用中的一个关键因素，包括生物燃料生产、生物活性化合物提取和褐藻胶基材料的改性。不同的褐藻胶裂解酶表现出独特的底物特异性，提供了广泛的酶，可以靶向褐藻胶分子的特定区域。这种变异对于各种生物和工业应用都很重要。到目前为止，大多数褐藻胶裂解酶都表现出对poly M的偏好或具有双功能。然而，对聚-G具有特异性亲和力的褐藻胶裂解酶的特性是有限的，AlyZu7已被鉴定为G型褐藻胶裂解酶。这种特异性对褐藻胶的有效降解和改性至关重要，并影响其结构和功能性质。![]()
图3. 45℃时(A)AlyRm6A-Zu7的降解产物分析；(B)45℃时的混合酶；(C)25℃时的AlyRm6A-Zu7；(D)AlyRm6A和AlyZu7的连续反应；(E)45℃时AlyRm6A-Zu7的降解产物分析；以及(F)25℃和45℃时AlyRm6A-Zu7降低的水解物产量的显著性分析。
4.AlyZu7和AlyRm6A-Zu7的降解产物分析AlyRm6A-Zu7具有完全反应的能力，在45和25℃下12 h内产生DP1-4和DEH。为了定量这些产物，以Tcalg1产生的DP1+DEH为单糖标准。在45℃时，AlyRm6A-Zu7在前6 h内表现出较快的初始产生DP1、DEH和AOS(DP2-4)，其中DP2为主要成分，其次是DP3和DP4(图3A)。在25℃时，AlyRm6A-ZU7菌株的初始产生量比45℃时慢，且产生量较少。在这个较低的温度下，AlyRm6A的活性降低，过程明显慢于45℃，导致DP2-4的产量减少(图3C)。随着反应的进行，DP2-4的产量持续增加，其中DP2是主要产物，其次是DP3。只产生了极少量的DP4。在25℃时，AlyRm6A-ZU7融合酶中AlyZu7的活性占主导地位，导致初始反应速度较慢，单糖的初始产量较低。然而，随着反应的继续，产生了大量的单糖，最终在12小时内完成反应(图3A和C)。对AlyRm6A-Zu7在25℃和45℃下产生的糖组分的定量分析显示出显著的变化。其中，DP3、DP2和总DP1+DEH的含量在两种温度下均显著高于其他条件。此外，在所有分析的糖中，DP4含量的差异是最明显的。这些结果表明，与25℃相比，AlyRm6A-Zu7在45℃时产生更多的AOS，而在45℃时单糖的产量显著降低。有趣的是，AlyRm6A-Zu7的还原糖产量在两种温度下没有显著差异，表明底物转化率相似。然而，它们在不同温度下的降解性能有显著差异，AlyRm6A在较高温度下表现出较高的活性，而AlyZu7在较低温度下表现出较高的活性(图3F)。在45℃下对AlyZu7在不同时间范围内进行的产品分析显示，其在25℃下的最佳性能，在45℃下1小时后活性显著下降50%，这突显了其有限的热稳定性。由于酶活性在高温下降低，AlyZu7‘S的初始反应速度很慢，12 h后反应完全，但在25℃时，与AlyRm6A-Zu7相比，DP1+DEH的产量显著低于AlyRm6A-Zu7。这一发现表明，与耐热的AlyRm6A的连接可能会略微提高AlyZu7’S的热稳定性(图3E)。
为了比较融合酶和混合酶的降解性能，分析了AlyRm6A和AlyZu7混合酶在45℃和pH 7.0时不同反应时间的产物。虽然两种酶在相同的时间范围内(12h)完成了反应，但融合酶的反应速度比混合酶快。此外，融合酶比混合酶产生更多的产物(DP1-4和DEH)，促进更有效的底物转化(图3B)。为了评价AlyZu7的S处理AlyRm6A产生的AOS的能力，我们对AlyRm6A进行了优化条件，然后利用其降解产物作为AlyZu7的底物。在整个反应过程中，AlyZu7有效地同时降解了AlyRm6A和褐藻胶产生的小分子糖。在12小时内，AlyZu7几乎完全将褐藻胶和小糖分子转化为单糖和DEH(图3D)。但仍有少量的DP2和底物残留。计算的还原糖浓度为14.23±0.28 mg/mL，底物转化率约为95%。然而，整个转化过程需要24小时，需要两个独立的反应阶段。这一延长的过程涉及额外的步骤，消耗更多的时间，并且需要使用两种不同的酶，从而导致费用增加。因此，为了增强在更短的时间内提高底物转化效率，我们的目标是利用融合酶AlyRm6A-Zu7并研究改变反应条件以高效地生产AOS和DEH。与AlyRm6A-Zu7进行了两步反应，首先在较高的温度下有利于AlyRm6A产生AOS，然后在25℃下优化AlyZu7的S功能。这种方法的目的是利用AlyRm6A中的AOS有效地转换衬底，并同时处理它们。早期的AOS产量不大，但随着时间的推移，产量显著增加。值得注意的是，35、40和45℃下1和2 h的AOS水平很高，25℃下的产量逐渐上升，3 h后达到显著水平(图4A)。接下来，我们重点关注DP1+DEH的产率。AlyRm6A-Zu7表现出较强的外切活性，尤其是在35℃时，2 h和3 h的Dp1+DEH产率高于其他温度。在最适温度下的反应后期，该酶随着时间的推移迅速增加DP1+DEH的产量(图4B)。最后，还考察了还原糖得率对底物转化效率的影响。在35、40和45℃下反应1h，还原糖得率适中，在2、3h时显著增加，在随后的反应阶段，还原糖得率在不同温度下迅速增加。值得注意的是，在35℃的反应后，25℃的还原糖产率最高(图4C)。这些结果表明，AlyRm6A-Zu7’S更倾向于较温和的温度，以获得高效的底物转化，在相对温和的条件下，尤其是在35◦℃下较长时间地保持较高的活性，该酶产生AOS和DP1+DEH的活性较高。
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图4.(A)褐藻胶寡糖、(B)DP1+DEH和(C)还原糖产率在不同反应阶段的变化。
考虑了时间和温度的影响，优化了AOS、单糖和还原糖的生成。在我们对还原糖得率的详细检查中，我们注意到在后一阶段持续6小时和12小时的反应的得糖率只有很小的差异。此外，在将不同的温度-时间配置与我们的控制条件(35℃处理3 h，25℃处理12 h)进行比较后，我们发现替代设置，如35℃处理2 h然后25℃处理12 h，40℃处理3 h然后25℃处理12 h，以及40℃处理2 h然后25℃处理12 h，与对照相比没有显著的差异(图5A，B)。进一步的分析表明，将反应时间缩短到6h会导致还原糖得率的显著差异。因此，35℃反应3 h，25℃反应6 h，或35℃反应3 h，25℃反应5 h，可以有效地取代35℃反应3 h，25℃反应12 h，反应时间缩短40%或46.67%，底物转化率为75%。分析了AOS和DP1+DEH的产率，为不同的工业目的量身定做了优化的生产。为了在较短的时间内获得较高的DP1+DEH产率，探索了在第二阶段保持第一阶段条件12h的反应。在35℃下反应3 h，然后在25℃下反应12 h，Dp1+DEH的产率与其他条件有显着差异(图5B和C)。后续分析表明，35℃反应3 h，25℃反应6 h，35℃反应3 h，25℃反应5 h，或35℃反应3 h，25℃反应4 h，可替代35℃反应3 h，25℃反应12 h，反应时间分别缩短40%、46.67%或53.33%，产率约为40%。
对于AOS的主导地位，也进行了类似的优化。45℃作用3 h，25℃作用12 h，45℃作用2 h，25℃作用12 h，无显著差异(图5E)。进一步分析表明，用45℃反应3 h，再用25℃反应6 h，可以取代45℃反应3 h，再用25℃反应12 h，反应时间缩短了40%，寡糖得率为45%(图5F)。AlyRm6A-Zu7在不同温度下表现出高效的底物降解和较高的转化效率。所得低聚合度的AOS具有显著的抗肿瘤、抗氧化等生物学效应。此外，对褐藻胶代谢至关重要的DEH的产生，为生物精炼增加了显著的价值。AlyRm6AZu7能在短时间内有效降解底物并产生多种糖组分。![]()
图5.(A，B)还原糖产量；(C，D)DP1+DEH产量；(E，F)褐藻胶寡糖产量的显著分析。融合蛋白AlyRm6A-Zu7是通过去除AlyZu7和AlyRm6A中的信号肽并将得到的蛋白与柔性连接物(GSG)连接而产生的。利用AlphaFold2，AlyRm6A-Zu7的预测结构包括三个不同的结构域：两个来自AlyRm6A，PL-6家族结构域(Val6-Lys397)和FlgD Ig样结构域(Phe486-Thr547)，以及一个来自AlyZu7的褐藻胶_lyase2超家族结构域(Glu596-Gly891)(图6A)。用Verify 3D软件对结构模型的质量进行了评估，结果表明，超过90.30%的AlyRm6A-Zu7残基在3D/1D图，表明模型质量令人满意。此外，使用Pro-check软件分析蛋白质结构的立体化学性质，通过Ramachandran图显示结果，证实结构精度满足高质量标准(图6B)。
对接模拟揭示了AlyRm6A和AlyZu7蛋白部分与底物的结合能，分别为−6.8千卡/摩尔和−6.9千卡/摩尔。AlyRm6A中的关键残基(Asn182、Arg188、Thr191、Lys221、Arg242和Tyr305)与底物形成了强烈的氢键。其中，Lys221和Arg242分别起催化碱和酸的作用，Asn182则与钙离子配位。同样，AlyZu7与特定残基(646Ser、693Gln、695His、860Ser和845Tyr)形成氢键，突出了693Gln、695His和845Tyr在底物催化中的重要性，这与序列比对结果(图6C)一致。在AlyRm6A-Zu7的催化活性中，这两个蛋白质参与了独立的反应。在AlyRm6A反应中，Lys221和Arg242分别起催化碱和酸的作用，而Asn182与钙离子配位。这些残基通过氢键与底物相互作用。此外，在PL7褐藻胶裂解酶家族中，高度保守的基序，如R*E*R、Q(I/V)H和Y*KAG*Y*Q，形成了对底物结合和催化至关重要的活性部位。相关褐藻胶裂解酶的诱变研究支持特定残基(例如Vwalg7A中的R98、H169和Y303)分别作为一般碱、酸和中和剂的作用。AlyZu7含有高度保守的残基693Gln、695His和845Tyr。这些残基是形成活性中心所必需的，参与与底物的氢键，并在底物结合和催化反应中发挥关键作用。这与AlyZu7中693Gln、695His和845Tyr残基对底物催化的意义一致，正如多序列比对所表明的那样。随着反应的进行，降解成AOS的海褐藻胶浓度进一步增加。AlyZu7使用AlyRm6A产生的AOS进一步修饰底物，如图3D所示。总体而言，底物和蛋白质之间稳定的相互作用确保了正常的酶反应。AlyZu7是一种未知的新型褐藻胶裂解酶，需要为后续的实验建立结构模型。使用AlphaFold2预测了AlyZu7的结构，并使用SAV6.0对其质量进行了评估。AlyZu7由一个17个氨基酸的信号肽和一个褐藻胶裂解酶2超家族结构域(Glu47-Gly342)组成，在3D/1D图上有91.40%的残基得分大于或等于0.2，表明模型的正确性。此外，Ramachandran图分析表明，超过80%的残基位于最有利的区域，证实了模型的可靠性(图4)。因此，AlphaFold2预测的AlyZu7模型可用于进一步分析。随后，准备了AlyZu7和AlyRm6A结构文件，并提交给HDOCK服务器进行分析。HDOCK的结果将对接得分排在−200以下，置信度得分超过0.7.对选定的顶级对接结果进行评估，以确定界面交互作用(表S3)。AlyRm6A和AlyZu7之间的相互作用主要涉及盐桥，其次是氢键和疏水作用。关键相互作用包括247Arg(AlyRm6A)、56Asp(AlyZu7)、186Arg56Asp和157His-70Asp，分别在3.5、3.2和2.1Å处形成了较强的盐桥相互作用。此外，223Glu(AlyRm6A)和68Lys、186Arg-70Asp、450Asp-95Asp、125Arg-70Asp(AlyZu7)分别在3.9Å、4.4Å、5.0Å和5.1Å处形成盐桥。此外，466Arg(AlyRm6A)和91Gly-98Ser(AlyZu7)之间的氢键距离分别为2.6和2.8。此外，在157His(AlyRm6A)和323Ala(AlyZu7)之间的疏水相互作用被观察到4.5Å(图S7)。AlyRm6A和AlyZu7之间的相互作用主要涉及盐桥和氢键，辅之以疏水相互作用，这对提高蛋白质的稳定性至关重要。离子键或盐桥是离子之间相互吸引的结果，通过连接由于正离子和负离子之间的相互吸引而产生的氨基酸残基，在蛋白质稳定性中发挥重要作用。蛋白质分子中存在的氢键通过减少折叠过程中的自由能来维持二级结构的稳定性并提高蛋白质的整体稳定性。疏水相互作用产生于疏水氨基酸必须避免与水接触，从而影响蛋白质折叠构象，从而调节蛋白质稳定性。因此，AlyRm6A-AlyZu7的相互作用主要依赖于疏水作用支持的盐桥和氢键，从而在一定程度上提高了AlyZu7蛋白的热稳定性。
本次研究开发了一种新型的融合酶AlyRm6A-Zu7，它结合了一个热稳定的内切型酶和一个新发现的外切褐藻胶裂解酶。这种酶表现出中性的pH分布，显著的热稳定性以及同时的内外降解活性，使褐藻胶能够高效地降解，而不依赖于单独的内-外切酶通常所需的协同作用。通过调节反应温度和反应时间，使原反应时间减半，底物转化率达到75%。DP1+DEH的产率达到40%，褐藻胶寡糖产量达到45%，具有较好的降解性能。水解液中单糖的显著存在突显了AlyRm6A-Zu7’S利用褐藻生产生物燃料的潜力。这一融合策略融合了具有高热稳定性和外切活性的褐藻胶内切酶，产生了具有优异热稳定性的双功能酶，为酶工程的工业应用提供了新的视角。
原文：Construction and characterization of a novel fusion alginate lyase with endolytic and exolytic cleavage activity for industrial preparation of alginate oligosaccharidesDOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.139695
