2024年7月来自山东大学的Lin Wei等人在JBC发表了一篇题为Discovery of a class of glycosaminoglycan lyases with ultrabroad substrate spectrum and their substrate structure preferences的研究性论文。
Abstract
糖胺聚糖（GAG）裂解酶通常具有严格的底物特异性，尤其难以同时降解具有不同类型糖苷键的GAG。本文从不同细菌中发现了一类新的GAG裂解酶（GAGases）。这些GAGase属于多糖裂解酶35家族，与已发现的GAGase同源性很低。最令人惊讶的是，GAGase不仅能降解HA、CS和HS三种类型的GAG，甚至其中一种还能降解褐藻胶。对结构偏好的进一步研究发现，GAGase选择性地作用于由非/6-O/N-硫酸化己糖胺和D-葡萄糖醛酸组成的GAG结构域，以及由D-甘露糖醛酸组成的褐藻胶结构域。此外，GAGase曾一度被推测是从褐藻胶裂解酶进化而来，但目前尚未发现过渡酶。GAGase的发现不仅拓宽了GAGase的类别，为具有特定结构的GAG的结构和功能研究提供了新的酶学工具，而且为GAGase的进化提供了候选者。
01
简介
糖胺聚糖（GAGs）是一类线性多阴离子多糖，由多个重复的含己糖胺的二糖单元组成，广泛分布于动物组织的细胞表面、细胞内和细胞外基质（ECM）中。根据二糖组成和二糖之间糖苷键的类型，GAG可分为以下几类：透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素（DS）、硫酸角蛋白（KS）和硫酸肝素（HS）/肝素（Hep）。组织中表达的GAGs的丰度和结构特性具有时间和空间特异性，具有特定结构的GAGs已被证明可与一系列蛋白质（如趋化因子、生长因子或其他ECM成分）相互作用，从而参与各种生理和病理过程。除KS不含己糖醛酸（HexUA）残基外，HA、CS/DS和Hep/HS均由含有己糖醛酸（D-葡萄糖醛酸（GlcUA）或L-艾杜糖醛酸（IdoUA））和己糖胺（D-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）或D-N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc））的重复二糖组成。在这些类别中，HA是最简单的非硫酸化GAG，由双糖GlcUAβ1-3GlcNAc通过β1-4糖苷键重复连接而成。相比之下，CS/DS和Hep/HS链要复杂得多，这是因为糖残基在生物合成过程中发生了硫酸化和差向异构化。CS链的基本骨架由重复的二糖GlcUAβ1-3GalNAc组成，通过β1-4糖苷键连接，并通过各种磺基转移酶对GlcUA/IdoUA的C-2以及GalNAc的C-4和C-6进一步修饰。同时，一些GlcUA残基会在葡萄糖醛酸C-5差向异构酶的作用下差向异构化为IdoUA。由-4IdoUA1-3GalNAc1-重复双糖形成的链被称为DS，因此CS和DS经常以CS-DS 混合结构的形式出现。与CS/DS的情况类似，由双糖-4GlcUA1-4GlcN/GlcNAc1-组成的HS/Hep前体在GlcUA的C-2、GlcNAc残基的C-3和C-6处硫酸化，GlcNAc可以去乙酰化，然后硫酸化形成GlcNS。此外，GlcUA还经常与IdoUA发生差向异构化反应，尤其是在Hep链中。
多糖裂解酶（PLs）通过β-消除反应催化含HexUA多糖的降解。与真核生物衍生的糖苷水解酶（GHs）通过水解机制裂解含糖醛酸的多糖不同，微生物衍生的多糖裂解酶不需要水分子参与降解含HexUA的多糖，而是从被作用的糖醛酸残基中移除一分子水，并在新生成的还原端糖醛酸残基的C4和C5上引入不饱和双键。GAG裂解酶是一系列微生物衍生的酶，属于PLs超家族，专门催化降解含HexUA的GAG。已发现的GAG裂解酶广泛分布于PL6、PL8、PL12、PL13、PL15、PL16、PL21、PL23、PL29、PL30、PL33、PL35和PL37家族。所有已发现的GAG裂解酶都具有底物特异性，能严格区分GAG链的糖组成和内部糖苷键。根据底物特异性，它们通常可分为以下几类：HA特异性裂解酶；CS/DS裂解酶，传统上称为软骨素酶（CSases）；Hep/HS裂解酶（Hepases）。迄今为止，尚未发现能降解HA、CS和HS三种GAG的GAG裂解酶。
本研究发现了一类属于PL35家族的新PLs，并将其命名为GAGases。与已发现的对HA/CS/DS或Hep/HS具有严格底物特异性的GAG裂解酶不同，GAGases可以同时降解三种类型的GAG（HA、CS和HS），其中一种甚至可以有效地裂解褐藻胶，这是一种完全不同的含HexUA的多糖，由D-甘露糖醛酸（M）和L-古罗糖醛酸（G）组成，M和G残基经常随机交替形成杂多糖醛酸块。对这些GAGases的基本生化特征和底物结构偏好进行了详细研究。具有超宽底物谱的GAGases的发现丰富了GAG裂解酶库，为具有特定结构的GAG的结构和功能研究提供了新的酶学工具，也有助于揭示糖胺聚糖裂解酶的进化过程。
02
结果
1.PL35家族GAGase的序列性质
在寻找新型GAG裂解酶时，研究人员注意到来自Spirosoma linguale DSM 74的一个推定基因（GAGase I），该基因在GenBank中被归类为肝素酶II/III，但与所有已发现的GAG裂解酶（包括各种肝素酶）的相似性很低。有趣的是，在基因数据库中发现了一系列GAGase I的同源序列，这些序列（GAGase I-VIII）都包含约1,800个碱基，编码含有624-648个氨基酸残基的~70 kDa蛋白（表1）。此外，这些序列由一个N端"DUF4962超家族"模块和一个C端"Hepar_II_III超家族"模块组成，这与PL15成员的情况相似，只是GAGase VI没有典型的N端模块（图1A）。此外，系统进化分析表明，这些未确定的序列与各种已确定的GAG裂解酶相距甚远，并独立地聚集在PL35家族中（图1B）。相比之下，这些潜在的GAG裂解酶不仅与PL35家族中的一种内切软骨素酶具有最高的同源性（同源性为35-37%，查询覆盖率为69%-77%），而且与PL33家族中的一种内切透明质酸裂解酶、PL15家族中的一种褐藻胶裂解酶和一种外肽酶、PL21家族中的两种肝素酶II以及PL34家族中的一种褐藻胶裂解酶的同源性也比较接近（图1B）。总之，这些独特的序列特性表明，这些GAGase的酶学特性具有潜在的新颖性。
图1.GAGase的功能模块和系统发育分析。
表1.GAGase的基因和蛋白质序列信息
2.GAGase的异源表达与纯化
将构建的pET30a-GAGase转入大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。培养表达载体的细胞并用IPTG诱导。上清液中的重组蛋白经超声和离心从pET30a-GAGase载体宿主细胞中提取，并用Ni-NTA亲和层析法纯化。根据SDS-PAGE分析结果，重组GAGase蛋白以可溶性形式成功表达，分子质量约为70kDa，并可通过单次Ni亲和层析纯化至约95%的纯度（图2）。
图2.重组GAGase的表达和纯化。
3.GAGases的底物特异性
为了研究这些潜在GAG裂解酶的酶学特性，分别重组表达和纯化了GAGase I-VIII。以各种GAG为底物评估了每种GAGase的特异性。令人惊讶的是，通过凝胶过滤色谱法分析所得反应物表明，GAGase I-V不仅能有效降解HA和各种CS变体，还能降解HS，甚至GAGase III也能显著降解褐藻胶，这表明这些酶的底物谱与已鉴定的GAG裂解酶不同。相比之下，GAGase VI-VIII的底物降解能力相对较弱且有限（图3）。值得注意的是，几乎所有这些酶都表现出不同的降解含GlcUA的HA和各种CS的能力，但不容易降解富含IdoUA的DS和Hep。此外，与富含4-O-硫酸化GalNAc残基的CS-A和CS-E相比，这些酶似乎能更好地降解富含6-O-硫酸化GalNAc残基的CS-C和CS-D（图3）。
为了进一步揭示这些GAGase的优选结构，在上述凝胶过滤分析过程中收集了用GAGase I降解的每种GAG的二糖部分（图3），并用液相色谱-离子阱飞行时间混合质谱（LCMS-IT-TOF MS）进行了分析。在HA/CS/HS的酶解物中检测到了378.10 m/z和458.06 m/z的两个主要峰，分别归属于不饱和N-乙酰化的非硫酸化二糖和单硫酸化二糖；在HS的酶解物中检测到了416.04 m/z的峰，归属于N-硫酸化的不饱和二糖（图4A）。此外，阴离子交换高效液相色谱法的二糖组成分析表明，非硫酸化二糖是来自各种CS的ΔHexUA1-3GalNAc （ΔO）和来自HS的ΔHexUA1-4GlcNAc（Δ0S）、单硫酸化的N-乙酰化二糖分别为CS的ΔHexUA1-3GalNAc(6S) (ΔC)和HS的ΔHexUA1-4GlcNAc(6S) (Δ6S)，N-硫酸化二糖对应于HS的ΔHexUA1-4GlcNS (ΔNS)（图4B）。这些结果表明，无论HA/CS/HS中己糖胺的结构和重复二糖单位之间糖苷键的类型如何，GAGase都更倾向于作用于由非/6-O-/N-硫酸化二糖组成的结构域。此外，GAGase I还能降解从小鼠乳腺癌4T1细胞和正常人胚胎肾脏293T细胞中提取的GAG，但与293T细胞中的GAG相比，GAGase I更喜欢4T1细胞中的GAG产生更多的非硫酸化二糖，这表明不同类型细胞中的GAG在内部结构上存在显著差异。
图3.PL35家族GAGase的产物分析。
图4.GAGase I降解的GAG最终产物中的二糖成分分析。
4.GAGase的基本酶学性质
以结构最简单的HA为底物，研究了这些酶的基本生化特性。除少数情况外，这些酶具有相同或相似的最适反应温度（40℃）和最适缓冲液（Tris-HCl，pH 7-8），大多数酶受碱金属离子Na+和K+的刺激较弱，但受各种重金属离子如Pb2+、Hg2+、Fe3+和Cu2+的抑制较强（表2）。值得注意的是，GAGase III和IV能明显受到K+的刺激，这可能与它们来源于水生细菌有关，而GAGase II、III和IV对Ca2+、Mg2+和Mn2+的刺激敏感，尤其是GAGase III，它受到Ca2+和Mn2+的强烈刺激（表2）。在各自的最佳反应条件下，这些酶对各种底物的比活性不高，但对HA和CS的活性相对较高（表2），这可能是它们通常被视为HA/CS裂解酶的原因。不过，研究人员发现这些酶，如GAGase I和IV，在40℃及以下的温度下表现出良好的稳定性。尤其是GAGase I，在最适温度（20℃）下可维持一周以上的高活性，这将弥补其在应用中的低比活性。此外，还计算了GAGase I-V对HA、CS-C和HS的Km值和Vmax值，结果表明它们对CS-C的Km值明显小于对HA和HS的Km值（表3），这进一步证实了GAGase更喜欢作用于高度6-O硫酸化的CS-C。
为了确定GAGase的作用模式，以HA为底物，用GAGase I进行时间降解实验。结果如图5所示，GAGase I一开始会产生一系列大的寡糖，然后随着时间的延长，寡糖产物的大小逐渐减小，这表明GAGase是内切GAG裂解酶。
表2.GAGase的酶学性质
表3.GAGase I-V对HA、CS-C、HS和褐藻胶的动力学分析
图6.对GAGase I降解各种GAG的最终产物进行分离和测序。
图7.GAGase的硫酸化模式偏好。
图8.GAGase I 对GAG的差向异构化偏好解。
图9.GAGase III对褐藻胶的差向异构化偏好。
03
讨论
GAG裂解酶不仅在微生物降解和利用GAG方面发挥着关键作用，而且也是对GAG进行结构和功能分析的重要工具。目前，CAZy数据库中已鉴定出多种GAG裂解酶，并根据其序列，特别是催化结构域的同源性将其分为13个PL家族。从底物类型来看，这些GAG裂解酶可分为三大类：HA特异性裂解酶，如来自Streptomyces hyalurolyticus或Streptococcus dysgalactiae的HYAL；CS/DS裂解酶，如来自Flavobacterium heparinum的CSase AC I和B以及来自Proteus vulgaris的CSase ABC I和II；HS/Hep裂解酶，如来自Flavobacterium heparinum的肝素酶I、II和III。值得注意的是，虽然大多数CS/DS裂解酶（除了DS特异性CSase B）都具有降解HA的活性，但还没有报道称任何GAG裂解酶可作用于所有三种含HexUA的GAG。毫无疑问，本研究中发现的具有HA、CS、HS甚至褐藻胶降解活性的GAGase将拓展对GAG裂解酶类型多样性和广泛底物谱的认识。
根据序列分析，GAGase属于最近建立的PL35家族，通过对蛋白质序列空间的合理探索，该家族中只有一个成员在大规模筛选新型碳水化合物活性酶中被报道。在GenBank数据库中，属于PL35家族的大多数假定蛋白被注释为"肝素酶"、"肝素酶II/III样蛋白"或"含DUF4962结构域的蛋白"，而PL35家族中唯一被报道的成员被鉴定为"内切软骨素裂解酶"。系统进化分析表明，"内切软骨素裂解酶"与GAGase聚类，但与GAGase的亲缘关系更远，这可能解释了为什么它在底物选择性方面与GAGase不同。另一方面，这种酶降解HA和HS的能力可能会被忽视，因为它对这些底物的活性太低，无法用传统方法（如之前研究中使用的还原糖分析法）进行检测。本研究中报道的GAGase与其他PL家族中所有已发现的GAG裂解酶的序列相似性很低（<22%），而且其底物谱比所有已发现的GAG裂解酶都要广，这表明发现了一类新的GAG裂解酶。
根据各种已鉴定的GAG裂解酶的底物选择性，这些酶应该对糖苷键的类型比对GAG链中单糖残基的组成更敏感。例如，许多已鉴定的HA/CS裂解酶可同时降解不同单糖组成但残基间糖苷键类型相同的HA和CS，而可降解相同单糖组成但糖苷键不同的HA和HS的酶却鲜有报道。相比之下，GAGase对底物结构和糖苷键立体异构形式的耐受性较高，可以裂解HA、CS和HS链中基本二糖单元之间的α-和β-1,4键。然而，通过使用具有特定结构的各种底物进行详细分析发现，GAGase对底物中单糖的硫酸化模式和差向异构化表现出严格的选择性。GAGase倾向于降解HA/CS/HS中的非6-O硫酸化结构域，但一旦CS中的GalNAc残基被4-O硫酸化或CS和HS中的HexUA残基被2-O硫酸化，GAGase就无法发挥作用。此外，GAGase对GAG中D-GlcUA残基的C-5差向异构体高度敏感，不能有效降解富含L-IdoUA的DS和Hep，这与其结构同源的CSase AC和肝素酶III的情况类似。
更有趣的是，GAGase III对结构与GAG完全不同的褐藻胶具有显著的活性，只能裂解由非C-5表聚D-M残基组成的polyM结构域。这是首次发现GAG裂解酶具有褐藻胶降解活性。与肠道和土壤中的其他GAGase相比，GAGase III具有更强的褐藻胶降解活性，这应该是由于它们来源于富含褐藻胶的水生环境。
与GAGs一样，褐藻胶也是一种含有HexUA残基的线性阴离子多糖。长期以来，研究人员一直困惑于为什么褐藻胶裂解酶具有"Hepar_II_III超家族"模块，却不能降解Hep/HS。从进化的角度来看，GAG裂解酶可能是通过适应底物多糖的进化而起源于褐藻胶裂解酶。本研究在GAGase中也发现了一个C端"Hepar_II_III超家族"模块，这表明它是从褐藻胶裂解酶到肝素酶的分化进化过程中保守的功能域。与各种典型的GAG裂解酶相比，GAGase的底物特异性要弱得多，因此可以降解三种含HexUA的GAG，甚至可以降解褐藻胶，但只能降解一些非/半硫酸化和非环聚化的初级结构，这可能是从褐藻胶裂解酶过渡到GAG裂解酶的功能特征。至于这些GAGase为何具有如此广泛的底物谱，另一项研究已经完成了GAGase的晶体结构和催化机理研究。
总之，具有超宽底物谱的GAGase酶的发现不仅改变了人们对GAG裂解酶底物限制的认识，进一步丰富了GAG裂解酶的类型，而且为研究GAG裂解酶的进化提供了潜在的候选物种。
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.107466
END
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