《JAFC》糖基转移酶UGT94E13结构导向工程高效生物合成Rebaudioside M8
文摘
科学
2024-07-12 22:56
江苏
2024年7月，来自江南大学的Lifeng Yang等人在JAFC上发表了一篇题为Highly Efficient Biosynthesis of Rebaudioside M8 through StructureGuided Engineering of Glycosyltransferase UGT94E13的研究性文章。
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通讯单位：Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Life Sciences and Health Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, P. R. China鉴于甜菊醇糖苷(SGS)的低卡路里、高甜度特性，开发具有改善口味特征的SGS是一个关键的焦点。Rebaudioside M8(Reb M8)是利用糖基转移酶UGT94E13将Rebaudioside D(Reb D)的C-13位糖基化得到的一种新的非天然SG衍生物，由于其甜度增强，具有进一步开发的前景。然而，UGT94E13的低催化活性阻碍了进一步的研究和商业化。本研究旨在通过半分子设计提高UGT94E13的酶活性，获得了一株UGT94E13-F169G/I185G，其催化活性提高了13.90倍。利用UGT94E13-F169G/I185G与蔗糖合成酶AtSuSy的级联反应回收尿苷二磷酸葡萄糖，有效地制备了Reb M8，产率达98%。此外，通过分子动力学模拟分析底物Reb D与酶的距离以及Reb D与葡萄糖供体之间的距离，发现缩短距离对糖基化反应活性的积极影响是UGT94E13-F169G/I185G催化活性提高的原因。因此，本研究解决了REB M8高效生产的瓶颈问题，为其在食品工业中的广泛应用奠定了基础。
介绍灵长类动物对甜味的自然偏好引导它们偏爱甜味而避免苦味，推动制糖业的进步，从甘蔗中提取蔗糖并开发人造甜味剂作为替代品。然而，蔗糖代谢会导致血压升高和肝脏代谢加剧，从而引发糖尿病、高血压和非酒精性脂肪性肝病等慢性疾病。此外，人工甜味剂，如三氯蔗糖和阿斯巴甜，可能有害健康，增加癌症以及心血管和神经疾病的风险，尽管它们的卡路里含量很低。因此，天然糖醇和植物来源的天然甜味剂被认为是蔗糖和人工甜味剂的更安全的替代品，享有更大的消费者信任和潜在的应用。在这些天然甜味剂中，甜菊醇糖苷(SGS)是优良的蔗糖替代品，被称为第三类甜味剂。SGS的安全性已经通过大量的试验验证，并得到联合国粮食及农业组织和世界卫生组织的批准。SGS是一类二萜类化合物，含有ent-kaurene骨架，包含60多种化学成分，并根据类型、数量、种类和表现出不同的器官感官特性而连接在C-13和/或C19位的糖基的连接方式仍然限制了其更广泛的商业化应用。开发具有改善感官特性的新型SGS是克服现有挑战的一种有前景的策略。根据糖基残基的结构和感官特性关系，其甜味和苦味随着糖基残基数量的增加而增加。因此，对现有的天然糖基进行糖基化修饰是提高甜度和降低苦味的有效策略。目前，通过糖基化修饰得到了众多的SG衍生物，包括Reb D，Reb I，Reb D2，Reb M，和M241，显著提高了甜味剂的质量。最近，本课题组利用栀子糖基转移酶UGT94E13对Reb D进行糖基化修饰，开发出了非天然SG衍生物Reb M。对Reb M8的结构进行了质谱学和核磁共振表征，证实它是一种在Reb D的C-13位引入葡萄糖的新型甜菊醇糖苷衍生物。对Reb M8的感官特性和生物活性的初步评价表明，其甜度和抗炎性因子肿瘤坏死因子-α的活性优于然而，UGT94E13在这种非天然生物合成糖基化反应中的催化活性较低，导致Reb M8的产量不足，从而限制了对其安全性和感官特性的进一步研究及其在食品工业中的应用。
本研究旨在通过半分子设计策略提高糖基转移酶UGT94E13的酶活性。对该组合突变体的催化活性进行了观察和分析。此外，通过将最优突变体与拟南芥蔗糖合成酶(AtSuSy)偶联，开发了一个用于合成Reb M8的高效级联反应系统，该酶已被广泛用于从具有成本效益的蔗糖来源中再生糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)。它在提高Reb M8产量方面发挥了关键作用，这不仅为SG甜味剂在全球市场上的竞争力提供了坚实的基础，而且对应对全球日益增长的降糖趋势具有战略意义。
UGT94E13的结构是用AlphaFold2预测的，如图1a所示。与已报道的与UGT94E13高度同源性的UGT91C152的晶体结构相似，UGT94E13也有两个典型的Rossman结构域(β/α/β)，N-末端结构域有7个β链，C-末端结构域有5个β链。这两个Rossman样结构域之间的酶口袋结合了底物Reb D和辅因子UDPG(图1b)，这也是进一步分子对接的位置。
对UGT94E13预测结构的Ramachandran图分析表明，362个残基(91.9%)位于最有利区域，30个残基(7.6%)位于额外允许区域，在非允许区域仅发现2个残基(0.5%)，即K194和V361。这证明了UGT94E13的预测结构的合理性和可靠性，以供进一步研究。
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图1.UGT94E13的预测结构和基于分子对接的UGT94E13关键位点的确定。(A)UGT94E13的预测结构。(B)用UGT94E13描述将Reb D转化为Reb M8的糖基化过程。(C)说明UGT94E13中可能与Reb D发生疏水作用的氨基酸残基。(D)说明UGT94E13中可能与Reb D发生氢键作用的氨基酸残基。氢键用蓝色虚线表示。(E)说明UGT94E13中的氨基酸残基位于装订袋中REB D的4Å范围内。
底物Reb D和糖基供体UDPG与糖基转移酶UGT94E13的分子对接根据预测的UGT94E13的结构，进行了定位突变的潜在位点的鉴定。UGT94E13结合口袋的空腔较大，可以容纳UDPG转移过来的葡萄糖部分。残基P80、F264和P291可能与Reb D疏水相互作用，从而促进其与UDPG的结合(图1c)。此外，残基H13、D174、E262和D362参与了与底物REB D的不同羟基形成氢键的过程(图1D)。此外，在底物结合袋内也发现了上述关键氨基酸残基H81、M83、K87、F113、P134、V135、M139、S143、K168、F169、R172、D181、R182、I185、Y263、T266、E269、V361和Q363(图1e)。首先，选择上述残基进行丙氨酸扫描，结果如图2a所示。突变体F169A和I185A的催化活性显著提高，分别是野生型UGT94E13的2.92倍和3.92倍。其他残基的催化活性相似或降低。因此，F169和I185被选为后续半饱和诱变的潜在位点，以进一步提高酶活性。在突变株UGT94E13的F169位(图2b)中，F169G和F169S的催化活性较F169A有所提高，分别是野生型UGT94E13的3.34倍和3.28倍。同时，当I185残基被空间位阻较小的脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸取代后，催化活性进一步提高。值得注意的是，I185G和I185S表现出显著的改进，分别达到了野生型的5.31倍和4.91倍。然而，其他空间位阻较大的突变体(I185W)会损害甚至失活UGT94E13的活性(图2c)。然后，将优势突变体(F169G、F169S、I185G和I185S)组合起来，进一步提高UGT94E13的活性。与野生型相比，组合突变体F169G/I185G的活性显著提高13.90倍(图2d)。因此，选择UGT94E13-F169G/I185G进行以下研究。
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图2.糖基转移酶UGT94E13的结构导向工程。(A)丙氨酸扫描结果。橙色柱代表与野生型相比催化活性显著提高的突变体。(B)F169点突变的结果。(C)I185点突变的结果。(D)组合突变的结果。UGT94E13作为诱变亲本酶，其活性归一化为1。橙色柱代表具有最高催化活性的突变体。误差条表示三次重复的标准偏差。ND表示未检测到。
首先，通过分子对接分析来研究F169和I185在UGT94E13中的位置以及它们突变为甘氨酸后催化活性增强的原因。如图3a，b所示，F169和I185都位于催化口袋的底部，非常接近Reb D的糖基化位点。将这些残基突变为甘氨酸扩大了UGT94E13的疏水结合口袋，导致提高底物REBD和REB M8的合成效率。然后，对UGT94E13和UGT94E13F169G/I185G进行了分子动力学模拟，进一步阐明了该组合突变体催化活性提高的机制。根据糖基转移酶催化机制，该过程开始于H13从位于葡萄糖部分D的C6上的羟基中提取质子。这启动了氧离子的产生，其随后对UDPG的C1位进行攻击。最终，这一序列通过建立1,6-糖苷键而导致Reb M8的形成。
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图3.UGT94E13-F169G/I185G增强催化活性的机理分析(A)结合口袋中F169和I185的位置。(C)UGT94E13和UGT94E13-F169G/I185G在糖D中H13的Nε与6-OH的H之间的距离的差异。(D)UDPG的C1P与糖D中6-OH的O之间的距离。(F)UGT94E13-F169G/I185G的典型催化构象。
因此，H13上的N-ε原子与H13上的研究了葡萄糖部分D上的C6羟基的氢原子，以及葡萄糖部分D上的6-羟基-O与UDPG的C1原子之间的距离。在100 ns MD模拟中，与UGT94E13相比，UGT94E1-F169G/I185G的这两个距离明显减小(图3c，d)。然后，分析了分子动力学模拟中具有代表性的UGT94E13(图3e)和UGT94E13F169G/I185G(图3f)的构象变化。在结构比较的基础上，突变体UGT94E1-F169G/I185G降低了这两个残基的空间位阻，扩大了酶口袋，使其更深更宽，使底物Reb D与酶(从2.9到1.8Å)和UDPG(从5.0到3.5)有更好的结合。这种构象变化更有利于激活葡萄糖D部分C6上的羟基，促进生成的氧离子对UDPG的亲核攻击，从而提高酶的催化活性。
5.UGT94E13及其突变体对Reb D的动力学参数分析在阐明了突变体提高催化活性的机理后，测量了它们的动力学参数，以进一步证实分子动力学模拟的结果。首先，对UGT94E13及其突变体(UGT94E13F169G、UGT94E13-I185G和UGT94E13-F169G/I185G)的最适pH和温度进行了优化(图4)。在50 mM Tris缓冲液中，UGT94E13及其突变体的最适pH为8.0。在pH为7.0−9.0的范围内，所有酶的相对活性都在70%以上，表明pH稳定(图4a)。然后，考察了温度在25~50°C范围内的影响。观察到所有酶的最适温度为35°C(图4b)，温度对酶活性有显著影响。野生型UGT94E13的相对活性在25℃和50℃时下降了一半以上，而单点突变UGT94E13-F169G和UGT94E13-I185G的相对活性下降到约60−70%，表现出略好的温度稳定性。此外，温度稳定性最好的双突变体UGT94E13−169G/I185G的相对活性高于70%，这表明催化活性的提高可能也与温度稳定性的改善有关。
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图4.UGT94E13及其突变体的最适pH和温度。(A)UGT94E13及其突变体的pH优化。(B)UGT94E13及其突变体的温度优化。
然后，在pH 8.0和35°C下测定了UGT94E13及其突变体的动力学参数，以进一步阐明催化性能的提高(表1)。突变株的Km值均降低，说明F169G、I185G和F169G/I185G突变提高了酶的亲和力。同时，所有突变体的kcat和kcat/Km值都显著增加，表明这些突变体，特别是UGT94E13F169G/I185G，催化效率(kcat/Km)从1.97mM−1min−1提高到24.37mM，是UGT94E13的12.4倍。这些结果很好地证实了MD模拟的结论。表1.UGT94E13及其突变体对REB M8的动力学参数
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6.UGT94E13-F169G/I185G和AtSuSy偶联反应制备Reb M8最后，目标是建立一个用于放大制备REB M8的级联反应。为了促进UDPG的再生，从拟南芥中引入了蔗糖合成酶AtSuSy，从而能够经济有效地利用蔗糖，并在制备Reb M8时不再需要UDPG。经SDS-PAGE和Western印迹分析证实，UGT94E13-F169G/I185G和AtSuSy在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达，并以可溶性部分的形式存在。随后，对包括pH、温度和蔗糖浓度在内的级联反应条件进行了优化(图5)。对反应缓冲液的pH进行了分析，以达到UGT94E13-F169G/I185G和AtSuSy活性的最佳平衡。PH为8.0的磷酸二氢钾(KPI)缓冲液对REB M8的催化活性最好(图5a)，并被选作进一步优化。然后考察了温度和蔗糖浓度对级联反应的影响(图5b，c)，结果表明最佳条件为40℃和500 mM蔗糖。
最后，在优化的反应条件下，利用UGT94E13的野生型和组合突变体与AtSuSy的级联反应，进行了25 m L(25 Mm)规模的Reb M8的制备试验。如图5d所示，在UGT94E13-F169G/I185G催化下反应10h后，Reb M8的产量达到24.53 mm(产率为98%)。相反，野生型的REB M8的产量是仅6.79 mM(得率27%)，证明本研究的诱变成功，为高效制备新型甜味剂Reb M8奠定了基础。综上所述，在合理设计糖基转移酶UGT94E13的基础上，根据其预测的结构，成功地开发了一种有效的糖基转移酶突变体UGT94E13，为高效合成新型潜在甜味剂Reb M8奠定了基础。根据分子动力学模拟，UGT94E13-F169G/I185G组合突变体的催化活性提高了13.90倍，这归因于酶口袋的改造使底物REB D与UGT94E13及其糖基供体更好地结合在一起。在UGT94E13-F169G/I185G与AtSuSy的级联糖基化反应中，有效地制备了24.53 mM的Reb M8，产率达98%。因此，本研究为进一步研究REB M8的感官特性，拓展其在食品工业中的应用奠定了坚实的基础。
原文：Highly Efficient Biosynthesis of Rebaudioside M8 through StructureGuided Engineering of Glycosyltransferase UGT94E13DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c03565
