2022年12月，来自Karlsruhe Institute of Technology (KIT)的Ulrike Sabine van der Schaaf等人在J. Agric. Food Chem.上发表了一篇题为Influence of Arabinan Fine Structure, Galacturonan Backbone Length, and Degree of Esterification on the Emulsifying Properties of Acid-Extracted Sugar Beet Pectins的研究性论文。
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通讯作者：Ulrike Sabine van der Schaaf; Daniel Wefers通讯单位：Institute of Process Engineering in Life Sciences-Food Process Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT), 76131 Karlsruhe, Germany; Institute of Chemistry-Division of Food Chemistry, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 06120 Halle/Saale, Germany甜菜果胶(sbp)以其乳化特性而闻名，但尚不清楚哪些结构元素对功能最重要。最近的结果表明，阿拉伯糖含量有决定性的影响，但所采用的方法不允许建立因果关系。在本研究中，对一个基本完整的SBP进行了选择性修饰，并分析了所获得的果胶的分子结构和乳化性能。脱酯反应只能适度地增加液滴大小。果胶主链的长度只影响同聚半乳糖醛酸主链被剪切到更高程度时的乳化特性。通过使用不同的阿拉伯糖修饰酶，证明了阿拉伯聚糖较高的比例和链长都会对SBPs的乳化性能产生积极影响。因此，能够对酸提取的SBPs的结构-功能关系进行优化，从而可以用于优化提取条件。
果胶是植物细胞壁和常用食品添加剂的重要成分。为了后者的目的，果胶是从植物材料，如苹果，柑橘，或甜菜果肉提取。然而，由于其高度复杂和不同的化学结构，功能性质的不同取决于植物材料和提取条件。来自苹果或柑橘果肉的果胶在工业上是最重要的，因为它们可以作为胶凝剂或增稠剂在各种应用中使用。相比之下，甜菜果胶(SBPs)表现出良好的乳化性能，但大规模的工业应用仍然受到阻碍的事实，结构-功能关系尚未完全了解。
果胶是一种复杂的杂多糖，主要由高聚半乳糖醛酸( HG )和鼠李半乳糖醛酸聚糖- I ( RG-I )亚基组成。此外，还有少量的RG - II和一些植物细胞壁中的木聚半乳糖醛酸。线型HG骨架由α - 1，4 -连接的d -半乳糖醛酸单元组成，可能在羧基衍生化和/或在O2 / O3位置与乙酸酰化。交替的α - 1，4 -连接的d -半乳糖醛酸和α - 1，2 -连接的l -鼠李糖残基构成了RG - I骨架，在鼠李糖单元的O4位置上可能被中性侧链阿拉伯聚糖和(阿拉伯)半乳聚糖取代。根据De Vries等的模型，“光滑”的HG区域与“多毛”的RG - I区域相连，形成较长的果胶骨架。与其他果胶相比，SBPs具有高含量的阿拉伯聚糖，其表现出高度的分支，不同的侧链结合在α - 1，5-位连接的l -阿拉伯糖骨架单元的O2和/或O3位置。除柑橘或苹果果胶外，SBPs中的阿拉伯糖和半乳糖单元与酚酸发生部分酰化，其中反式阿魏酸在定量上最为重要。SBP的另一个比较独特的性质是具有高水平的相关蛋白。由于SBP结构的高度复杂性，建立明确的结构-功能关系是困难的。在前期的研究中，通过对43个SBPs的提取和详细表征，我们观察到阿拉伯糖含量与各自模型乳液的液滴尺寸相关。分子量(权重平均值, Mw)、甲基化程度( DM )和乙酰化程度( DAc )之间没有发现明确的相关性，但表明这些结构参数对乳化特性也有贡献。然而，由于在酸提取过程中同时发生多种结构变化，这种方法可能会假设结构与功能之间的关系，但没有得到证实。此外，很少发生的结构修饰的影响，例如果胶骨架的断裂，无法确定。因此，有必要对单一结构要素进行选择性改造，以清晰地建立结构-功能关系。一些先前的研究已经使用这种方法来研究SBPs的乳化特性和结构组成之间的关系。但作为改性起始原料的果胶均为市售SBP。由于工业提取侧重于产率和胶凝/增黏性能，因此采用低pH值和长提取时间。因此，商业果胶的特征是已经高度改性的结构，例如，它们通常具有低阿拉伯聚糖含量的特征。然而，我们证明了苛刻的萃取条件，因而较高的改性程度，导致了乳化性能的恶化。因此，通过对商业SBP进行改性只能获得有限的信息，因为无法得出关于酸提取过程中已经被改性的结构元素的影响的结论。因此，本研究的目的是通过对相对温和的酸萃取得到的SBP进行选择性修饰，确定阿拉伯糖、HG主链长度、DM和DAc对乳化性能的影响。
在之前的研究中，只观察到在较高的DM值下，液滴尺寸有轻微的变小趋势，但分布很分散。因此，可以假设DM对乳化性能的影响很小。相比之下，较小的液滴大小与DAc在15%至35%之间相关，而在35%至52%之间无关。这些结果表明，良好的乳化性能需要最低的DAc含量。为了改性DM和DAc，在相对温和的酸性条件下提取的SBP ( 80°C、pH 2、1 h)用NaOH ( 3 mmol / g )处理15 min ( DE15 )和180 min ( DE180 )，并与未处理的样品( SBP0 )进行比较。根据预实验，这些温和的碱性条件适合减少DM和DAc，而不会促进半乳糖醛酸骨架的过度β -消除。为了尽量减少β -消除反应的发生，在冰上进行了脱酯实验。SBP0，DE15和 DE180的结构分析证实了碱处理脱酯。与未经处理的样本(表1)比较，处理后的样本的阿魏酸和蛋白质含量略为下降，而单糖组成(图 S1)和蛋白质含量则大致相同。唯一的主要修改是DM和DAc。DM从74.1% (SBP0)下降到21.6% (DE15)和14.0% (DE180) ，而DAc从49.0% (SBP0)下降到26.4% (DE15)和22.7% (DE180)。因此，较高的 d90，3个DE15(0.95 μm)和 DE180(0.95 μm)值可归因于DM和DAc的变化。然而，考虑到DM和DAc的急剧下降，稳定液滴尺寸的增加相对较小(SBP0:0.80 μm)。此外，DE15和DE180能够稳定相同的液滴大小，尽管不同的DM和DAc。自 d90以来，3个样品在贮存30天后没有明显变化，部分脱酯对乳液稳定性没有明显影响。与我们以前研究中的其他酸提取SBPs相比，本研究中的修饰果胶的 DM 和 DAc显著低于几乎所有研究样品。然而，选择性修饰的果胶显示明显小于不同酸提取的果胶，相似或更高的DM和DAc (> 1μm)。因此，我们的结果清楚地表明，DM 和DAc对乳化性能有一定的影响，但并不是唯一的，也可能不是最重要的参数。这与Chen等的结果一致，他们也发现了DM和DAc对性能的一定影响，但尽管几乎完全脱酯，但影响相对较小。表1.在冰上用NaOH (3 mmol/g果胶)脱酯化15 min (DE15)和180 min (DE180)前(SBP0)和后(SBP0)的特征液滴尺寸d90,3和结构参数
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在我们以前的研究中，没有观察到Mw和乳滴大小之间的明显相关性。此外，在酸提取过程中，阿拉伯糖侧链最容易被水解；因此，即使在酸水解过程中HG骨架发生了某种程度的改变，阿拉伯糖水解的效果也会被覆盖。因此，无法得出果胶骨架长度对功能性影响的结论。根据多毛和光滑区域模型，果胶由相互连接的HG和RG-I切片组成，形成一个长的聚阴离子骨架。这种骨架的长度可能对乳化性能很重要，因为它可能通过空间和静电效应影响油水界面的稳定性。为研究果胶骨架长度对乳化剂乳化性能的影响，采用内切酶-α-1,4- d聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的混合物处理SBP 20 min (HG20)、60 min (HG60)和180 min (HG180)，并与无酶孵育混合物(对照)进行比较。内切酶-α-1,4- d聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶诱导HG主链部分断裂，生成分子量不同但侧链结构相同的果胶。酶促均半乳糖酸修饰的条件是基于初步的实验，旨在评估酶的量，允许部分但仍然显着减少主链的长度。对分子量分布和单糖组成的分析证实了Mw从520 kDa(对照)逐渐减少到220 kDa (HG180)，而总体果胶组成没有重大变化(表2)。因此，可以假设得到的果胶总骨架长度不同。DAc也保持稳定，而DM则从64.8%(对照)下降到44.0% (HG180)，这可能是由于酶制剂的甲基酯酶副活性。然而，考虑到脱酯化实验的结果和我们之前的研究，就其对乳液液滴大小的影响而言，这种幅度的DM减少很可能可以忽略不计。因此，主链长度的变化是影响乳化性能的唯一相关结构修饰。有趣的是，对照样品和HG20的d90,3值几乎相等，尽管Mw有明显差异。然而，进一步降低Mw会导致乳化液液滴尺寸(HG60和HG180)的增加。此外，乳状液中半乳乳酸主链的强修饰导致乳状液稳定性下降。用HG180制备的乳剂在贮存30天后，d90,3明显增加。此外，从视觉上观察到HG180有轻微的乳化现象，这可能是由于与其他样品相比，HG180的液滴尺寸更大。表2.内切-α-1,4- d聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶混合酶促改性后sbp的平均分子量(Mw)、DM和DAc分别为20 min (HG20)、60 min (HG60)和180 min (HG180)
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因此，HG和RG馏分的分离一旦超过一定水平，对sbp稳定乳剂的乳化性能和长期稳定性有较强的影响。HG20稳定的小液滴可以用一个基本完整的HG-RG网络的存在来解释。另一种解释是，HG和RG元素潜在分离的负面影响最初被由于Mw降低而增加的扩散速率和吸附动力学的积极影响所补偿。这两种相反的效应也可以解释为什么文献中报道了高Mw对sbp乳化性能的正面和负面影响。然而，必须强调的是，HG主链的修饰对于酸提取的sbp来说很可能是次要的，因为阿拉伯糖侧链在果胶酸提取过程中最容易被降解尽管如此，我们的结果证实了果胶骨架长度对乳化性能的一定影响，这是在使用其他提取方法(如高压灭菌法)时必须考虑的。在我们之前的研究中，阿拉伯糖的部分，即阿拉伯糖侧链的部分，与乳化性能有明显的相关性。一个因果关系的假设，也支持的事实，一个可比的相关性没有观察到其他参数。然而，由于酸提取过程中多个结构元素被修改，因此不能完全排除其他参数对SBP功能更重要的可能性。此外，不可能评估阿拉伯糖的结构组成是否对SBP的乳化性能有影响。为了选择性修饰阿拉伯糖侧链，将果胶与内切α-1,5-1-阿拉伯糖酶或 α-1-阿拉伯糖苷酶一起孵育。这些酶专门水解阿拉伯糖，而其他结构元素没有修饰。虽然内切α-1,5-1-阿拉伯糖酶催化阿拉伯糖骨架的α-1,5-连接的线性切片的随机水解，但是α-1-阿拉伯糖苷酶切断末端α-1-阿拉伯糖残基。因此，内切α-1,5-1-阿拉伯糖酶切割预计将导致链长的整体减少。由于末端阿拉伯糖单元主要存在于与阿拉伯糖骨架的O2位和/或O3位结合的侧链中，预计α-l-阿拉伯糖苷酶水解将导致线性化的阿拉伯糖链，并且在过度水解后，几乎完全的阿拉伯糖降解。为了获得不同程度的阿拉伯糖修饰，分别采用10U/g (AA10和AF10)和40U/g (AA40和AF40)两种酶活进行酶促培养。根据Wefers和Bunzel.，应用的酶浓度是基于阿拉伯糖侧链的酶谱分析。对单糖组成的分析清楚地表明，酶对阿拉伯糖进行了成功的修饰(图1)。与对照样品相比，酶处理果胶中的阿拉伯糖含量明显降低。由于对相对组成的分析，阿拉伯糖的降解导致其他单糖的部分增加。然而，半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖之间的比率在所有样品中都具有可比性，这证实了阿拉伯糖的选择性修饰。改性果胶的阿拉伯糖含量在29% ~ 8%之间，表现出不同程度的改性。值得注意的是，α-Larabinofuranosidase比内切-α-1,5- l -阿拉伯糖酶更能降低阿拉伯糖的含量。这一结果是意料之中的，因为所应用的SBP具有高度分支的阿拉伯糖结构，从而为α- l -阿拉伯糖醛酸苷酶催化水解提供了多种靶点。尽管对阿拉伯豆进行了显著的改性，但检测到相当的反式阿魏酸含量(表3)。因此，反式阿魏酸含量对改性果胶功能的影响不大。此外，AA10、AA40和AF10的Mw降低幅度适中，而AF40的Mw降低幅度为其他改性果胶的一半，为对照果胶的三分之一。因此，根据结果，AA10、AA40和AF10的乳化性能不可能仅仅因为Mw的减少而显著降低。所有样品都显示液滴大小明显增加，验证了阿拉伯人与稳定液滴大小有因果关系的假设。然而，没有观察到液滴大小与阿拉伯糖含量之间的直接相关性。例如，AA10和AF10的阿拉伯糖含量明显不同，但d90,3值相当。虽然阿拉伯糖修饰在乳液制备后立即对液滴大小分布有明显影响，但在储存30天后，仅观察到液滴大小略有增加，并且仅适用于使用较高酶浓度处理的样品(表3)。因此，乳状液的长期稳定性最多受到阿拉伯糖组分改性的轻微影响。![]()
图1.内切-α-1,5- l -阿拉伯糖酶(AA)和α- l -阿拉伯糖糠苷酶(AF)酶修饰后的SBPs单糖组成，酸水解后用HPAEC-PAD测定。用10 U/g (AA10和AF10)或40 U/g (AA40和AF40)的酶孵育进行修饰。对照样品不加酶孵育。所有数值均以平均值表示(n = 3)。GalA:半乳糖醛酸，Rha:鼠李糖，Ara:阿拉伯糖，Gal:半乳糖，GlcA:葡萄糖醛酸，Xyl:木糖。
表3.内切-α-1,5- l -阿拉伯糖苷酶(AA)和α- l -阿拉伯糖醛酸苷酶(AF)修饰后的sbp的特征液滴大小d90,3、重量-平均分子量(Mw)和反式阿魏酸含量(t-FA)
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由于功能差异不能用其他结构修饰如反式阿魏酸含量和分子量来解释，因此它们必须与阿拉伯糖结构有关。因此，使用甲基化分析进一步表征果胶样品，以确定阿拉伯多糖部分的糖苷键的部分(图2)。此外，使用Wefers和Bunzel描述的寡糖分析方法来获取不同结构元件的发生信息(图3)。![]()
图2.用内切-α-1,5- l -阿拉伯糖酶(AA)和α- l -阿拉伯糖醛酸苷酶(AF)修饰SBPs后的Arabinan连锁组成，通过甲基化分析确定。分别用10 U/g (AA10和AF10)或40 U/g (AA40和AF40)的酶孵育进行修饰。对照样品不加酶孵育。数据一式两份，以平均摩尔量表示，相对于所有阿拉伯糖键的总和。完整的中性糖连锁分析见表S1。Ara:阿拉伯糖，f:呋喃糖，p:吡喃糖。
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图3.酶解后分别用内切-α-1,5- l -阿拉伯糖酶(AA)和α-Larabinofuranosidase (AF)对sbp进行酶修饰后的阿拉伯寡糖组成进行HPAEC-PAD测定。用10 U/g (AA10、AF10)或40 U/g (AA40、AF40)的酶孵育进行修饰。对照样品不加酶孵育。所有数值均以平均值表示(n = 3)。
对照果胶的糖苷键清楚地表明，在相对温和的条件下提取的sbp含有复杂的，高度分支的阿拉伯糖。1,5-、1,3,5-、1,2,5-和1,2,3,5-连接的阿拉伯糖铀糖单元的部分表明，大约每秒钟主链被一个侧链取代。SBP的Arabinans主要在O3位置分支，而O2位置或两个位置的取代较少。这些结果被酶解的低聚糖证实，这些低聚糖主要是o3支链低聚糖A-4a, A-6a, A6b和A-7b。此外，A-6a, A-6b和A-7b的显著部分表明存在高度分支的骨干区域。内切-α-1,5- larabinanase的酶修饰明显减少了阿拉伯糖的部分(图1)，但只导致了阿拉伯糖整体结构的轻微改变:1,5-和1,3,5-连接的阿拉伯糖铀糖单元的部分适度减少，而末端阿拉伯糖铀糖单元的部分增加。这些结果与较短的阿拉伯糖链的存在是一致的，这些链仍然高度分支。低聚糖分析证实了这一点，低聚糖分析产生了具有显著部分复合低聚糖a -6a, a -6b和a -7b的可比低聚糖谱。相比之下，α- l -阿拉伯糖醛酸苷酶消化后得到几乎完全线性化的阿拉伯糖链。AF10和AF40都以1,5链和末端阿拉伯糖铀糖单元为主，只有一小部分其他糖苷键。酶解的低聚糖也证实了其几乎是线性的结构，其中以线性双糖A-2a为主。然而，从AF10到AF40，末端和1,5-链阿拉伯糖铀糖单位之间的比例增加。因此，可以得出AF10含有较长的线性阿拉伯糖链，而AF40只含有很短的阿拉伯糖链。这些结果与单糖分析的数据非常一致(图1)。此外，其他中性糖的糖苷键表明，阿拉伯糖被特异性修饰。此外，1,2-和1,2,4-连接的鼠李糖单位之间的比例表明，阿拉伯链没有从RG-I 骨架切断。基于以下考虑，可以得出结论，阿拉伯糖链的长度似乎对乳化性能有显著影响：AA40和AF10具有相当的阿拉伯糖含量(图1)；然而，AA40含有高度分枝的阿拉伯蛋白，而AF10主要含有线性阿拉伯蛋白。因此，可以假设AF10具有更高的链长，其功能优于AA40。从AF10 (d90,3: 0.94 μm)到AF40 (d90,3: 1.20 μm)的液滴尺寸明显增加也支持了较长的阿拉伯糖链的有利作用，因为这两种果胶之间的主要区别是链长度。然而，不能排除分支的程度也会影响功能性质。相比之下，乳剂的长期稳定性不受阿拉伯糖链长度减少的显著影响。研究结果表明，不同结构的果胶单位对果胶乳化性能的影响。阿拉伯糖链长度相关的事实表明，空间效应是决定性因素。然而，由于DAc对功能也有一定的影响，RG-I和HG主链疏水性可能也起作用。相反，阿魏酸取代引入中性侧链的额外疏水性似乎不太重要。可以进一步得出结论，果胶的骨架必须具有最小尺寸才能表现出良好的乳化性能，这很可能是因为它们必须覆盖油滴的一定面积。
先前对商业SBPs的研究没有观察到阿拉伯糖含量对稳定液滴大小的明显影响。这很可能是商业SBPs在酸萃取过程中大量水解阿拉伯豆的结果。在我们最近的研究中建立了阿拉伯糖部分与乳化特性之间的明确相关性之后，我们现在能够证明阿拉伯糖确实对酸提SBPs的功能有关键影响。通过分析不同的酶修饰果胶，我们也证明了长阿拉伯糖链对乳剂液滴大小有积极的影响。此外，我们发现HG主链长度和DAc是重要的，但只有在它们被广泛修饰的情况下。然而，这些参数在酸性条件下不容易被修改。这项工作的结果不仅扩展了酸提 SBPs 的结构-功能关系的知识，而且表明，有必要采用温和的提取程序，以充分发挥 SBPs 作为乳化剂的潜力。
原文：Influence of Arabinan Fine Structure, Galacturonan Backbone Length, and Degree of Esterification on the Emulsifying Properties of Acid-Extracted Sugar Beet PectinsDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c07460
