2024年5月，来自Chinese Academy of Fishery Sciences的Chengcheng Jiang等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Comparative Study on Enzymatic Characteristics of Two κ-Carrageenases from Carrageenan-Degrading Bacterium Catenovulum agarivorans DS2的研究性文章。
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通讯单位：Jiangsu Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resource, Lianyungang 222005, Chinaκ-卡拉胶酶在卡拉胶的高值化利用中发挥着重要作用，反应温度、热稳定性、催化效率、产物组成等是其能否大规模应用的关键因素。学习已经证明C端非催化结构域 (NonCD) 可能会影响酶促κ-卡拉胶酶的性质，为探索不同性质的κ-卡拉胶酶，特别是催化产物提供了一种策略。κ-卡拉胶酶(CaKC16A 和 CaKC16B)，来自嗜琼胶卵链菌 DS2，并进一步进行了表征。生物信息学分析表明，CaKC16A 含有NonCD，而CaKC16B没有。CaKC16A 表现出更好的酶促CaKC16B具有比CaKC16B更优异的性能，包括热稳定性、底物亲和力和催化效率。CaKC16A的非环糊精截短后，其热稳定性、底物亲和力和催化效率均显著下降，表明非环糊精在维持良好催化性能方面起着至关重要的作用。酶促CaKC16A降解κ-卡拉胶生成高度单一的κ-新卡拉胶六糖，CaKC16B生成单一的κ-新卡拉胶二糖；CaKC16A可降解β/κ-卡拉胶生成高度单一的脱硫酸基κ-新卡拉胶六糖，CaKC16B生成κ-新卡拉胶二糖和脱硫酸基κ-新卡拉胶六糖。此外，本文还提出CaKC16A和CaKC16B参与B/KC代谢途径并发挥不同的作用，为获取不同性质的κ-卡拉胶酶提供了新的思路。
红藻是一种可再生生物资源，年产量非常大。卡拉胶是一些红藻细胞壁的主要成分，由α-1,3-d -β-半乳糖(D-Gal，G-unit)和β-1,4-3,6-脱水-α- d-半乳糖(D-AHG，DA/D-unit)组成。根据硫酸化双糖单体不同，卡拉胶通常分为κ-卡拉胶(KC)、ι-卡拉胶(IC)、λ-卡拉胶(LC)，其双糖单体分别为G4S-DA、G4S-DA2S、G2S-D-2S,6S。此外，从Furcellaria lumbricalis中提取的一种混合型卡拉胶(β/κ-卡拉胶，B/KC)由于其优异的成膜能力而受到广泛关注，该卡拉胶由两种二糖单元，G-DA 和 G4S-DA。据报道，卡拉胶寡糖是由卡拉胶水解而来的，具有多种生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤，消炎，抗病毒和抗菌活性，这意味着它们在食品、制药和农业行业具有巨大的应用潜力。
基于卡拉胶酶的生物法是制备卡拉胶寡糖理想的环境友好型方法，特别是对于特定结构的卡拉胶寡糖。目前已报道的卡拉胶酶大致可分为κ-、ι-、λ-和β-卡拉胶酶4类，各类型卡拉胶酶对底物特异性不同，其中κ-卡拉胶酶是研究最多的一个类型，属于糖苷水解酶家族16亚家族17(GH16_17)。大多数 κ-卡拉胶酶由 GH16 催化结构域 (CD) 和一个或多个 C 端非催化结构域 (Non CD) 组成，包括碳水化合物结合模块 (CBM) 家族 92， 细菌免疫球蛋白样结构域 (Big_2)(一种 CBM)和 Por_Secre_tail (PorS)。一些学习证明了这些Non CDs对卡拉胶的底物结合能力。κ-卡拉胶酶PpCgk (PpBig_2)中存在的Big_2 NonCD和κ-卡拉胶酶OUC-FaKC16A (FaPorS)中存在的PorS NonCD表现出与KC的结合能力，κ-卡拉胶酶Cgk16A(WaCBM)中存在的CBM NonCD表现出与KC和IC的结合能力。进一步研究表明，非环糊精由于其与底物的结合能力，在维持κ-卡拉胶酶的热稳定性和催化能力方面起着至关重要的作用。来自紫菜假交替单胞菌的κ-卡拉胶酶PpCgk中Big_2非环糊精的截短导致其催化效率和热稳定性的下降。而且，截短该Big_2非环糊精后，κ-新卡拉二糖/κ-新卡拉二糖(Nκ2/Nκ4)的比例由1.19上升到1.79。在之前的学习研究中发现，来自海藻黄杆菌(Flavobacterium algicola)的κ-卡拉胶酶OUC-FaKC16A中PorS NonCD的截短也导致其催化效率、热稳定性和金属离子耐受性下降，特别是其水解KC的最终产物由Nκ4变成了Nκ2。这些二 学习发现 Big_2 和 PorS NonCDs 都可能影响酶促为我们挖掘具有不同性质的κ-卡拉胶酶提供了新的思路酶促特性，尤其是催化产品。
为了验证上述想法，κ-卡拉胶酶 CaKC16A 和 CaKC16B，来源于同一细菌Catenovulum agarivorans DS2, 被选中。之所以选择CaKC16A和CaKC16B作为研究对象，是因为它们具有不同的结构域组成。利用InterPro进行初步生物信息学分析提示CaKC16A含有GH16 CD和未知功能域(UNFD)，而CaKC16B仅含有GH16 CD。进一步的结构模拟表明该UNFD由7个β链组成，与PpBig_2和FaPorS的模拟结构相似。因此，推测该UNFD可能负责底物结合。这将导致酶促CaKC16A 和 CaKC16B 的特性。因此，在当前学习， 这些κ-卡拉胶酶被表达，并进一步研究过比较他们的酶促对KC和B/KC均表现出良好的性能。此外，还突出了它们在制备各种卡拉胶寡糖方面的潜力。
1.CaKC16A和CaKC16B的序列分析和表达在之前的学习中，26个与卡拉胶代谢相关的基因分析细菌菌株嗜琼胶卵链菌DS2揭示了κ-卡拉胶酶编码基因 CaKC16A 和 CaKC16B。CaKC16A和CaKC16B的核酸序列分别为1380和744 bp，分别编码459和247个氨基酸。生物信息学分析表明，CaKC16A含有一个GH16 CD和一个未知的功能结构域，而CaKC16B仅含有一个GH16 CD(图1 B)。与CAZy数据库中之前报道的κ-卡拉胶酶相比，CaKC16A和CaKC16B的系统发育分析表明，它们位于不同的小分支上(图1A)，表明它们的氨基酸序列存在差异。此外，CaKC16A与其他含有Big_2或Por_SNon CD的κ-卡拉胶酶位于不同的分支上(图1A)，这可能是因为其 UNFD 与这些 Big_2 和 Por_S NonCD 没有明显的序列相似性。CaKC16A 与Zobellia galactanivorans的 ZgCgkA 显示出最高的序列相似性(~43%) ，但序列覆盖率仅为~60%，表明其为新颖性。CaKC16B 与来自Colwellia echini 的CeCgkA 的相似性最高(~47%) ，序列覆盖率约为98%。![]()
图 1. (A) CaKC16A 和 CaKC16B 与已报道的 κ-卡拉胶酶的系统发育分析。(B) CaKC16A 和 CaKC16B 的保守结构域。(C) 纯酶 CaKC16A 和 CaKC16B 的 SDS-PAGE。Big_2：细菌免疫球蛋白样结构域，PorS：Por_Secre_tail，UNFD：未知功能结构域，SP：信号肽，nonCD：非催化结构域，M：标记，PE：纯酶，CE：粗酶。
为了进一步研究和比较它们的催化性能，含有二构建不含信号肽的κ-卡拉胶酶编码基因,转化大肠杆菌RTS BL21(DE3)进行蛋白表达,同时质粒中含有(His)6 -tag编码基因用于纯化。SDS-PAGE结果表明,经Ni 2+ -NTA亲和层析分离可得到纯的CaKC16A和CaKC16B (图1 C),其开放阅读框编码蛋白的预测分子量(Mws)分别为53.8和44.0 kDa,与SDS-PAGE结果一致。首先确定了它们的最佳反应温度和pH值，结果表明CaKC16A和CaKC16B分别在50 °C/pH 8.0和40 °C/pH 6.0表现出最佳活性(图2A~D)，且CaKC16A表现出比CaKC16B更宽的温度和pH适应性。至于它们的热稳定性，在不同温度下孵育1 h后，CaKC16A在30和40 °C下仍能保持100%的残留活性，而CaKC16B在30和40 °C下分别能保持89%和57%的残留活性(图2A、B)。进一步研究和比较了它们在30和40 °C下的长期热稳定性。如图2E、F显示，30 °C下保温24 h后CaKC16A仍有87%的残留活性，而CaKC16B仅保留了24%的残留活性；40 °C下保温6 h后CaKC16A仍保留了47%的残留活性，而CaKC16B则失活，说明CaKC16A具有较好的热稳定性。![]()
图 2. 温度对 (A) CaKC16A 和 (B) CaKC16B 活性和热稳定性的影响。pH 对 (C) CaKC16A 和 (D) CaKC16B 活性的影响。(E) CaKC16A 和 (F) CaKC16B 在 30 和 40 °C 下孵育 2、4、8、12 和 24 小时后的热稳定性。所有测量均重复进行三次，误差线表示测量的标准偏差。
因此，HG和RG馏分的分离一旦超过一定水平，对sbp稳定乳剂的乳化性能和长期稳定性有较强的影响。HG20稳定的小液滴可以用一个基本完整的HG-RG网络的存在来解释。另一种解释是，HG和RG元素潜在分离的负面影响最初被由于Mw降低而增加的扩散速率和吸附动力学的积极影响所补偿。这两种相反的效应也可以解释为什么文献中报道了高Mw对sbp乳化性能的正面和负面影响。然而，必须强调的是，HG主链的修饰对于酸提取的sbp来说很可能是次要的，因为阿拉伯糖侧链在果胶酸提取过程中最容易被降解尽管如此，我们的结果证实了果胶骨架长度对乳化性能的一定影响，这是在使用其他提取方法(如高压灭菌法)时必须考虑的。在最佳反应条件下，CaKC16A 的Km、k cat和k cat / K m值分别为 3.45 mg/mL、33.21 s –1和 8.63 mL·mg –1 s –1。相比之下，CaKC16B 的值分别为 4.78 mg/mL、0.62 s –1和 0.13 mL·mg –1 s –1(图 S1A、B)。这表明与已报道的 κ-卡拉胶酶 PpCgk(k cat值为 8.85 s –1)和 OUC-FaKC16A(k cat值为1.52 s –1)。综合考虑，不含非环糊精的CaKC16A比CaKC16B具有更高的最适温度、更宽的温度和pH适应性、更好的热稳定性、更高的底物亲和力和催化效率。到目前为止，只有三种不含非环糊精的κ-卡拉胶酶被报道，包括来自Colwellia echini的CeCgkA ，Ph1664 来自Paraglaciecola hydrolyticaS66T26，GH16A来自Pseudoalteromonas fuliginea PS47。其中，仅酶促对CeCgkA进行了性质表征，结果表明CeCgkA在35 ℃下保温0.5 h后活性即丧失70%左右，热稳定性较差；经测定其比活性为2.52 U/mg(453.15 μg/min/mg)，催化能力较差。
底物特异性测定结果表明，CaKC16A对KC的活性最高，对B/KC、IC和LC的相对活性分别为43.65%、1.60%和28.35%(图3)。CaKC16B对KC和B/KC的活性相当，对IC和LC的相对活性分别为1.80%和26.15%(图3)，说明CaKC16A和CaKC16B具有不同的底物水解偏好性。
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图 3. CaKC16A 和 CaKC16B 对 κ-卡拉胶 (KC)、β/κ-卡拉胶 (B/KC)、ι-卡拉胶 (IC) 和 λ-卡拉胶 (LC) 的水解活性。
HPLC检测显示，CaKC16A在1h内将KC降解为Nκ4和少量的κ-新卡拉胶糖(Nκ6)，生成的Nκ6随着反应的进行又转化为Nκ4和Nκ2，其最终产物由Nκ4和少量Nκ2组成(图4 A)。CaKC16B将KC降解为单独的Nκ2，随着反应的进行没有其他寡糖产生，其最终产物只含有Nκ2(图4 B)。虽然已经鉴定出大量的κ-卡拉胶酶，但具有高产物特异性的酶仍然很少，据我们所知，其中只有3个表现出很好的产物特异性：来自Vibrio sp. SY01的CgkA ，来自Polaribacter sp. NJDZ03 的Car3026 ，以及来自F. algicola的 OUC-FaKC16A ，其产物分别为Nκ2、Nκ2和Nκ4。因此，本文描述的CaKC16A和CaKC16B分别有可能成为制备Nκ4和Nκ2的有希望的工具。![]()
图 4. (A) CaKC16A 和 (B) CaKC16B 对 κ-卡拉胶的降解产物的 HPLC 分析。(C,E) CaKC16A 和 (D,F) CaKC16B 对 β/κ-卡拉胶的降解产物进行 HPLC 和 MS 分析。Nκ2：κ-新卡拉二糖，Nκ4：κ-新卡拉四糖，Nκ6：κ-新卡拉六糖。
鉴于CaKC16A和CaKC16B对B/KC具有良好的水解活性，我们还通过HPLC监测了它们对B/KC的水解产物。如图4 C所示，CaKC16A首先在1小时内催化B/KC生成P1，然后随着反应的进行，P1逐渐积累并成为主要产物。P1的保留时间介于Nκ4和Nκ6之间，这表明它可能是脱硫酸盐的Nκ6。MS进一步表明P1是去除一个硫酸基团的脱硫酸盐Nκ6(图4 E)。但去除的硫酸基团在P1中的具体位置尚不清楚，从卡拉胶降解菌 Zobellia uliginosa用于确定这一点。ADAG 特异性作用于新卡拉胶寡糖 (NCOS) 非还原端的第一个 α-1,3-糖苷键并释放 D-AHG，但NCOS应为 β-新卡拉胶二糖(Nβ2) 的非还原端。HPLC 分析表明ZuGH129A能够进一步降解 P1生成新产品(图 S2A)，且其非还原端由 Nβ2 组成，因此可以推断 P1 的结构为 DA-G-(DA-G4S) 2(图 S2C)。如图4 D 所示，CaKC16B 先催化 B/KC 在 1 h 内生成 P2、P3 和 Nκ2，随后它们逐渐积累，最终产物以 P3 和 Nκ2 为主。P2 的保留时间也介于 Nκ4 和 Nκ6 之间，但大于 P1，表明 P2 可能是脱硫酸盐化的 Nκ6，二或去掉三个硫酸基。P3的保留时间介于Nκ2和Nκ4之间，表明它可能是脱硫酸化的Nκ4。MS显示P3为去掉一个硫酸基的脱硫酸化Nκ4(图4 F)，但没有出现P2对应的质子峰，可能是因为P2的含量较低。同时利用ZuGH129A对P3的具体结构进行了测定，MS提示ZuGH129A可以进一步降解P3生成脱硫酸化的κ3(G-DA-G4S)(图S2B)，从而揭示P3为DA-G-DA-G4S(图S2C)。结果，CaKC16A降解B/KC生成的主要产物为DA-G-(DA-G4S) 2，而CaKC16B的主要产物为DA-G-DA-G4S和Nκ2。与之前报道的 OUC-FaKC16A 相比，CaKC16A 水解 B/KC 所得产物组成更均匀，尽管两者的主要产物都是 DA-G-(DA-G4S)2。因此，CaKC16A在制备结构特异性的脱硫酸化NκCOS方面具有更大的优势。另外，OUC-FaKC16A在NonCD部分截短后，其主要产物变为DA-G-DA-G4S和Nκ2，与CaKC16B一致。结合CaKC16A与CaKC16B在KC和B/KC降解产物上的差异，可以推断这些可能是由于CaKC16A中存在的NonCD所致。另一NonCD化合物Big_2也被证实能调控κ-卡拉胶酶PpCgk的水解产物，产物中的Nκ2/Nκ4比值由1.19变为1.79，说明截短该NonCD后，Nκ2的生成量增加。作者认为，出现这种现象的原因是Big_2结构域的卡拉胶结合能力，使得催化模块在完成一次水解后更难与底物分离，从而产生更多的Nκ4。
为验证非环糊精在CaKC16A中的作用，表达并纯化了截短的突变体CaKC16AΔ，预测的分子量为41.6 kDa，与SDS-PAGE结果一致(图5 A)。然后通过在40 °C下孵育酶来测定CaKC16AΔ的热稳定性。孵育1小时后，CaKC16AΔ仅保留了49.52％的残留活性，而野生型酶并未显示活性损失(图5 B)，表明在截短非环糊精后，CaKC16A的热稳定性降低。此外，其K m和k cat值分别为6.75 mg/mL和14.63 s –1(图 S1C)。这表明，CaKC16A 的非环糊精截短后，其底物亲和力和催化效率均降低。同样，κ-卡拉胶酶 PpCgk 和 OUC-FaCK16A 的非环糊精截短也导致其热稳定性、底物亲和力和催化效率降低。此外，其水解产物在截短后也发生了一定的变化，但CaKC16AΔ向KC和B/KC方向水解的主要产物仍为Nκ4和脱硫酸化的Nκ6、DA-G-(DA-G4S) 2 (图S3 )，未见明显变化，表明不同κ-卡拉胶酶的不同NonCDs可能在调节产物组成方面起着不同的作用。此外，CaKC16A的NonCDs与κ-卡拉胶酶PpCgk、Big_2、PorS和CBM的NonCDs无明显的序列相似性，OUC-FaKC16A和 Cgk16A，模拟结构表明该非环糊精由7个β链组成，与PpBig_2和FaPorS的模拟结构相似。此外，考虑到其对CaKC16A催化活性和热稳定性的影响，我们推测该非环糊精可能也参与了底物结合，但这一假设还有待进一步研究证实。![]()
图 5. (A) 纯酶 CaKC16AΔ 的 SDS-PAGE。(B) 40 °C 下孵育 2、4、8、12 和 24 小时后 CaKC16AΔ 的热稳定性。M：标记物，PE：纯酶。
5.CaKC16A 和 CaKC16B 参与 B/KC 代谢途径海洋生物的B/KC代谢途径细菌P. hydrolytica S66 T由 Schultz-Johansen 等人提出。在此降解过程中，B/KC 转化为寡糖需要 κ- 和 β- 卡拉胶酶的参与，但它们负责不同多糖基序的水解。κ-卡拉胶酶 Ph1664 仅降解 KC 基序产生 Nκ4 和 Nκ2，而 β-卡拉胶酶 Ph1656 和 Ph1663 降解 B/KC 基序产生脱硫酸化的 Nκ6 和 Nκ4。本文描述的 CaKC16A 和 CaKC16B 在降解 B/KC 中的作用说明它们可能参与了嗜琼胶卵链菌DS2的 B/KC 代谢途径。。结合生物信息学分析，CaKC16A和CaKC16B涉及的KC和B/KC代谢途径如图6所示。首先，CaKC16A和CaKC16B共同分解KC产生Nκ2，再分解B/KC产生DA-G-DA-G4S和Nκ2。然后，DA-G-DA-G4S在GH167外切卡拉胶酶(GenPept登录号WP_035015386.1和WP_035015073.1)作用下水解产生Nβ2和Nκ2，S1_19 G4S-硫酸酯酶(GenPept登录号WP_200870143.1和WP_035014430.1)去除Nκ2上的G4S硫酸基团产生Nβ2。第三，GH127 外切-α-3,6-脱水-d-半乳糖苷酶 (ADAG)(GenPept 登录号 WP_035015085.1 和 WP_035014433.1)将 Nβ2 完全转化为二单体 D-Gal 和 D-AHG。最后，D-Gal 被 Leloir 途径利用。D-AHG 转化为d -甘油醛-3-磷酸 ( d -Gly-3-P) 和丙酮酸，通过四步代谢酶促途径，由 D-AHG 脱氢酶 (D-AHGD)(GenPept 登录号 WP_035015061.1)、3,6-脱水-d-半乳糖酸环化异构酶 (D-AHGAC)(GenPept 登录号 WP_035015062.1)、2-酮-3-脱氧-d-半乳糖酸激酶 (KDGK)(GenPept 登录号 WP_035014435.1)和 2-酮-3-脱氧葡萄糖酸特异性醛缩酶 (KDGA)(GenPept 登录号 WP_035014434.1)组成。这为我们提供了对 κ-卡拉胶酶在 B/KC 代谢途径中的作用的新认识卡拉胶降解细菌，而之前的报告仅关注它们在 KC 代谢途径中的作用。![]()
图 6. 拟议的 κ-卡拉胶和 β/κ-卡拉胶代谢途径嗜琼胶卵链菌 DS2涉及 CaKC16A 和 CaKC16B。Nκ2：κ-新卡拉二糖，Nκ4：κ-新卡拉二糖，d -Gal：d -半乳糖，d -AHG：3,6-脱水-d -半乳糖，d -AHGD：d -AHG 脱氢酶，d -AHGAC：3,6-脱水-d -半乳糖酸环化异构酶，KDGal：2-酮-3-脱氧-d -半乳糖酸，KDPGal：2-酮-3-脱氧-6-磷酸-d -半乳糖酸。此外，这种通过多种酶的联合作用将多糖降解为二糖的方式二在琼脂糖降解菌中，也提出了一种或多种水解酶，其产物不同。例如，S. coelicolor A3(2) 中的琼脂糖代谢途径含有二β-琼脂酶DagA和Sco3487，其水解产物分别为新琼脂四糖(NA4)和新琼脂二糖(NA2)。弧菌EJY3菌株琼脂糖代谢途径含有3种β-琼脂糖酶VejGH50A、VejGH50B、VejGH50C，其中VejGH50B和VejGH50C能降解琼脂糖，生成新琼脂四糖(NA4)和新琼脂二糖(NA2)，其中NA4为主要成分；VejGH50A能将琼脂糖完全降解，生成NA2。如图S5所示， S. coelicolor A3(2) 和弧菌EJY3 菌株中琼脂糖转化为 NA2 的降解过程与嗜琼胶卵链菌DS2中的 KC 和 B/KC 降解过程相似。通过以上研究分析，二参与多糖降解的水解酶往往具有不同的水解产物组成，为探索具有不同产物的水解酶提供了新思路。据此，另一种卡拉胶降解菌Rhodopirellula sp. SWK7 被发现具有κ-卡拉胶酶，命名为 RsKC16A(GenPept 登录号 WP_009104871.1)和 RsKC16B(GenPept 登录号 WP_009098509.1)。结合序列和结构分析，表明 RsKC16A 由 GH16 CD 和NonCD 组成，而 RsKC16B 仅含有 GH16 CD(图S6)。从酶促本文描述了 CaKC16A 和 CaKC16B 之间的特性学习，可以推断，酶促RsKC16A 和 RsKC16B 之间的特性。因此，开发具有不同酶促可以从卡拉胶代谢途径的角度初步提出其特性。总之，κ-卡拉胶酶 CaKC16A 和 CaKC16B 已成功表达并鉴定。CaKC16A 表现出优越的酶促特性，包括最适温度、热稳定性、底物亲和力和催化效率。进一步截断CaKC16A的非环糊精，其热稳定性、底物亲和力和催化效率确实下降，这意味着非环糊精在维持良好酶促属性。值得注意的是，这些κ-卡拉胶酶对KC和B/KC均有不同的水解产物，CaKC16A能降解KC产生高度单一的Nκ4，而CaKC16B产生单一的Nκ2。CaKC16A能降解B/KC产生高度单一的脱硫酸化的Nκ6DA-G-(DA-G4S) 2 ，而CaKC16B则产生Nκ2和脱硫酸化的Nκ4DA-G-DA-G4S。这表明CaKC16A和CaKC16B可作为制备κ-和β/κ-杂化寡糖的有力工具。最后，探讨了它们在嗜琼胶卵链菌DS2的B/KC代谢途径中的潜在功能。并提出了进一步探索不同水解产物的κ-卡拉胶酶的策略。
原文：Comparative Study on Enzymatic Characteristics of Two κ-Carrageenases from Carrageenan-Degrading Bacterium Catenovulum agarivorans DS2DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c02102
