2024年7月，来自华南理工大学大学的Yu Du等人在JAFC上发表了一篇题为Simultaneously Enhanced Catalytic Activity and Thermostability of a Baeyer−Villiger Monooxygenase from Oceanicola granulosus by Reshaping the Binding Pocket的研究性文章。
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通讯作者：Yunjian Ma;Yonghua Wang通讯单位：School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China;School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China
Abstract
Baeyer−Villiger单加氧酶(BVMOS)催化各种环酮类化合物氧化成内酯，为合成香料和药物成分提供了一条很有前途的途径。然而，其催化活性和热稳定性较差，限制了其在医药和食品工业中的应用。在这项研究中，成功地通过改变结合袋的形状来提高来自Oceanicola granulosus的Baeyer−Villiger单加氧酶(OgBVMO)的催化活性和热稳定性。结果突变体OgBVMO-re对所测试的支环酮的活性增加了1.0至6.4倍，同时熔点提高了3℃，半衰期(T1/2(45℃))延长了2倍。分子动力学模拟表明，重塑结合口袋可以增强氨基酸残基之间的运动相关性，合适的底物结合口袋大小，有益的表面特征，更低的能量障碍和更短的亲核距离。这项研究很好地证明了酶活性和热稳定性之间的权衡，通过重塑底物结合口袋，为进一步工程其他酶铺平了道路。
内酯是一种环羧酸酯。具有五个(γ)或六个(δ)-环的内酯是水果和牛奶香味的特征成分，在食品和香料工业中有广泛的应用。此外，一些多环内酯是众所周知的药物，目前作为各种医药问题的生物活性化合物，用于不同类型的制药工业。一些例子是双环和多环γ-内酯，应用于许多有益的生理功能，如抗肿瘤，抗癌，抗炎和免疫抑制。由于它们在自然界中的裸露存在而被化学合成Baeyer−Villiger单加氧酶(BVMO)可以催化各种环酮和脂肪酮分别氧化成内酯和酯。与使用间氯过氧苯甲酸或过氧化氢的化学氧化相比，由于在温和的反应条件下使用分子氧作为氧化剂，酶促Baeyer−Villiger氧化更环保。BVMO具有良好的区域和立体选择性，以及底物范围，使它们对食品和制药行业具有吸引力。然而，许多BVMO的催化活性和稳定性在许多情况下仍然相对较低。
研究人员尝试从嗜热微生物中获取高热稳定性BVMO。到目前为止已经重组生产和表征了近100种BVMO，只有三种酶的稳定性突出：来自Thermobifida fusca的苯丙酮单加氧酶(PAMO)，来自Thermocrispum municipal的环己酮单加氧酶(TmCHMO)，和来自Thermothelomyces thermophila的多环酮单加氧酶(PockMO)。然而，这些生物催化剂的底物范围有限，主要作用于小分子的芳香族、环脂肪酮或仅作用于相对大的分子。从应用的角度来看，它们将限于作用于结构要求高的化合物，就像许多δ-内酯和药物的情况一样。此外，工程学试图通过合理的设计来提高它们对广泛底物的活性。作为PAMO的合理工程的例子，通过删除S441和A442残基来缩短活性部位环导致了一种接受更大底物的变体。重新设计CHMOArthroin的活性部位获得了有利于正常内酯的产品产量。然而，这些研究忽略了热稳定性，这阻碍了BVMOs在工业生产中的应用。此外，关于BVMOs提高催化活性和热稳定性的研究很少。因此，需要一种新的策略来提高BVMOs的催化活性和热稳定性，以增强其酶特性，实现大规模应用。利用定向进化、序列比对和计算机辅助设计的方法对Limosilactobacillus fermentum NCC3057的4,6-α葡聚糖基转移酶(Δ)的环路进行了优化。结果表明，ΔGtfB环区的大部分极性残基被刚性的脯氨酸残基取代，提高了ΔGtfB的热稳定性。Fraaije小组描述了几种情况，在活性部位不同于PAMO和CPMO的残基通过在选定的位置交换氨基酸来靶向它们的对应位置。他们获得了许多作用于底物的突变体，这些突变体不被野生型PAMO接受。到目前为止，对BVMOS的分子修饰研究很少集中在二级结构置换来重塑结合口袋，而底物结合口袋与酶性质之间的关系也很少被阐明。在之前的工作中，表达并鉴定了Oceanicola granulosus 的Baeyer−Villiger单加氧酶(OgBVMO)。它具有较宽的底物范围，但活性和热稳定性不理想，不能满足内酯工业生产的要求。在本研究中，利用AlphaFold2在TmCHMO结构(PDB ID：5M10)的基础上建立了OgBVMO模型。然后，根据已报道的具有优异酶性质的PAMO的结构信息对其结合口袋进行了重塑，以进一步提高OgBVMO的热稳定性和催化活性。此外，还进行了分子动力学(MD)模拟，以深入了解这一策略。这项工作是提高BVMO活性和热稳定性的新探索，可能有助于指导BVMO和其他酶的分子修饰，扩大其应用前景。
为了阐明影响OgBVMO催化活性和热稳定性的结构基础，重叠并分析了OgBVMO和PAMO(T.fusca的苯丙酮单加氧酶)(PDB ID：1W4X)的蛋白质结构。OgBVMO和PAMO之间最显著的差异是底物结合口袋中的二级结构(图1A)。在OgBVMO中有一个环，而在PAMO中，对应的位置是α-螺旋(图1B，C)。因此，用PAMO中的α-螺旋(S439-V448)替换了OgBVMO中的环(S437-L443)，构建了OgBVMO的突变体OgBVMO-Re，这可能会提高OgBVMO的热稳定性和催化活性。![]()
图1.OgBVMO的结构分析和位点选择(A)OgBVMO和PAMO的结构重叠，OgBVMO和PAMO在底物结合口袋中的环状和α-螺旋分别以红色和蓝色突出显示。(B)OgBVMO底物结合口袋部分替换中的残基S437-L444。(C)部分替换PAMO底物结合口袋中的S439-V448残留物。
2.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的制备与表征为了研究OgBVMO-WT和OgBVMORe的表达水平和酶学性质，在大肠杆菌中表达了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re，并用Ni-NTA亲和层析法进行了纯化。纯化的酶通过SDS-PAGE分析检测到。结果表明，OgBVMO-WT和OgBVMO-Re均一，表观分子质量为60 kDa，与理论分子质量一致。选择了10种不同支链的环酮为底物，考察了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的催化活性。如图2B所示，OgBVMO-Re对被测底物的催化活性显著提高，约为OgBVMOWT的1-6.4倍。结果表明，通过取代底物结合口袋附近的8个氨基酸残基，OgBVMO的催化活性显著提高，这与的预测高度一致。表1列出了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re对10种不同支链环酮的反应动力学参数。与OgBVMO-WT相比，OgBVMO-Re的底物亲和力(Km)降低了1.0~2.1倍，催化效率(kcat/Km)提高了1.2~4.1倍。所有底物的OgBVMO-Re的kcat/Km值均高于OgBVMO-WT，表明OgBVMO-Re的催化效率可能高于OgBVMO-WT，这与OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的比活性结果基本一致。![]()
图2.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re对不同支链环酮的催化活性比较(A)OgBVMO将支链环酮转化为内酯的方案。(B)OgBVMO-WT和OgBVMO-Re对不同支链环酮的催化活性。(C)本研究中使用的底物。
通过测量t1/2(45°C)和Tm值来评价热稳定性。OgBVMORe的T1/2(45°C)和Tm值分别增加到60分钟和45.5°C，比OgBVMO-WT增加了2倍和3°C(图3A，B)。还测量了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的热稳定性。如图S8所示，OgBVMO-Re的最佳温度为30℃，与OgBVMO-WT的最佳温度一致。OgBVMO-WT保持在初始酶活的50%，温度范围为20~50℃，最大温度范围为55℃，比OgBVMOWT的温度范围高5℃。为了进一步评价碎片置换对OgBVMO热力学稳定性的影响，用CD谱分析了OgBVMO二级结构的变化。与OgBVMO-Re相比，OgBVMO-WT的α-螺旋结构没有明显变化(图3C)。蛋白质中的芳香族氨基酸具有荧光特性，对环境影响非常敏感；因此，蛋白质荧光强度的变化可以间接反映其构象的变化。OgBVMO-Re的初始荧光密度与OgBVMO-WT相似，热处理后的增加值小于OgBVMO-WT(图3D)，表明OgBVMO-Re具有掩埋芳香族残基的能力。![]()
图3.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的热力学稳定性和热诱导内源荧光光谱变化测定(A)T1/2(45°C)。(B)OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的蛋白质热位移分析。(C)利用CD光谱确定二级结构。(D)内源荧光光谱测定。
通过分子动力学模拟研究了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的催化行为。首先对蛋白质和2乙基环戊酮络合物的两个模型进行100ns动态模拟，得到能量最低、稳定性最高的络合物结构，为后续催化机理的研究奠定基础。图S4A显示，这些模型的RMSD值快速上升，然后趋于稳定。在OgBVMO-Re模型中，RMSD的波动较大，这可能增加了FAD的C4a与底物的羰基氧进行亲核攻击的几率，并在一定程度上促进了酶的催化活性。OgBVMO-Re中大多数氨基酸的均方根波动(RMSF)也较大(图S4B)，表明该蛋白质在溶剂中的运动比野生型更强。这一结果可能有助于活性部位和底物之间的结合。为了进一步探索结合口袋重塑带来的变化，在整个模拟过程中，使用动态互相关图分析来评估酶系统的运动，特别是在Cα原子位置上。相关运动是酶结构刚性提高的另一个指标。如图4所示，相关运动(两个残基向同一方向移动)和反相关运动(两个残基向相反方向移动)分别表示为红色和蓝色区域，而白色区域相关性较低。与OgBVMO-WT系统相比，通过重塑结合口袋，增加了对酶稳定性有积极影响的相关运动。这些观察结果可能会加强局部残基相互作用网络，提高热稳定性和催化活性。![]()
图4.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re中的新兴动态网络。(上)OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的动态互相关图(DCC)。(下)在303K时，OgBVMO-WT和OgBVMO-Re在3D结构水平上的动态互相关关系。随着≥0.7%的增加，残基之间的互相关关系在结构上以红线表示。蓝色虚线框表示与OgBVMO-WT相比，OgBVMO-Re中的残基相关性增加。
为了揭示不同类型OgBVMO-Re催化性能改善的结构基础，分析了OgBVMO-WT-2-丙基环己酮和OgBVMORe-2-丙基环己酮配合物底物结合口袋周围的内部结构变化。在 OgBV-MO-WT 中，观察到一个狭窄的通道允许底物进入活性中心（图 5A、C）。然而，OgBVMORe创造了一个开放的空间，使底物很容易进入催化中心(图5B，D)。然后，监测了MD模拟过程中OgBVMO-WT和突变体OgBVMO-Re底物结合口袋的体积和表面积的大小变化。结果表明，在整个分子动力学模拟过程中，OgBVMO-Re的平均体积和表面积均小于OgBVMO-WT(图5E，F)。减小的尺寸有利于底物与酶的接触，这与先前的报道一致。![]()
图5.使用MD模拟比较OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的衬底结合口袋结构。(A)OgBVMO-WT和(B)OgBVMO-Re的整个结构的表面表示。(C)OgBVMOT和(D)OgBVMO-Re底物结合袋区入口处的放大图。(E)在分子动力学模拟过程中，OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的衬底结合口袋中的表面积的大小变化。(F)在分子动力学模拟过程中，OgBVMO-WT和OgBVMO-Re衬底结合口袋中体积的大小变化。
5.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的表面特征接下来，分析了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的整体静电势和疏水性。如图6所示，OgBVMO-WT底物结合口袋中特殊的二级结构的替换，将局部表面静电势从中性改变为负(图6)，导致突变体的表面净电荷比OgBVMO-WT增加。酶的表面净电荷对其热分解和再折叠行为有重大影响。通过改变蛋白质表面电荷的分布来增加表面净电荷可以增强蛋白质的热稳定性。更高的表面净电荷可以通过阻止酶聚集来促进可逆复性，这有利于热稳定性。还发现OgBVMO-Re中底物结合口袋的入口区从亲水变为疏水(图6)。口袋疏水性的增加可以增加疏水底物的可及性，从而促进活性部位与底物之间的结合。![]()
图6.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的静电势(上)和疏水性(下)分析。用ChimeraX软件输出静电势和疏水性的结果。静电势的变化用带虚线的黑色省略号标记(上图)。疏水性的变化用带虚线的红色省略号标记(底部)。
氧化反应的启动是由NADPH的结合所介导的，NADPH处于执行黄素还原的合适位置。随后，还原的酶与氧反应形成黄素-过氧化氢中间体。最后，底物结合并被形成Criegee中间体的黄素-OO̅基团中的亲核剂攻击(图7A)。为了证明底物和酶的潜在反应活性，对OgBVMO-WT及其变体OgBVMO-Re与2-丙基环己酮的络合体系进行了分子动力学模拟。对两个络合体系进行了分析，并对FAD的C4a原子与2-丙基环己酮的羰基氧原子之间的距离进行了统计分析。结果表明，在整个分子动力学模拟过程中，2-丙基环己酮到FAD的C4a原子的平均距离比OgBVMO-WT的平均距离要短(图7B)。然后，基于分子动力学模拟计算了2-丙基环己酮与OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的结合自由能(图7C)。OgBVMOWT-2-丙基环己酮的结合能为−21.40kcal/mol，而OgBVMO-Re-2-丙基环己酮的结合能为−25.49kcal/m ol，说明OgBVMO-Re与2-丙基环己酮的结合亲和力强于OgBVMO-WT。这些结果与OgBVMO-Re对2-丙基环己酮的亲和力增强是一致的。还分别显示了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re与底物的相互作用，如图S7所示。如图S7所示，OgBVMO-WT仅与Arg329形成氢键，而OgBVMO-Re分别与Arg335、Ala440和Leu441形成氢键。结果与熔点、t1/2、氨基酸残基之间的运动相关性、底物结合口袋的大小、表面特征、结合能和亲核距离一致。![]()
图7。(A)亲核攻击示意图。对于FAD，R是核糖醇二磷酸腺苷。2-丙基环己酮为底物。(B)分子动力学过程中FAD的C4a原子与底物的羰基氧原子之间距离的变化。(C)OgBVMO-WT或OgBVMO-Re与2-丙基环己酮的结合自由能。
7.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re对内酯的生物转化为了验证OgBVMO酶工程对内酯生产的影响，以2丙基环己酮为底物，测定了OgBVMO-WT和OgBVMO-Re的转化率。如图8所示，OgBVMO-WT在5h后达到了明显的最大转化率57%。OgBVMORe的转化率提高到了82%。这可能与突变体OgBVMO-Re的催化活性和热稳定性增强有关。这种转化率的提高突显了OgBVMO-Re在工业应用中的潜力，特别是在需要合成内酯的行业中。总之，Baeyer−Villiger单加氧酶(OgBVMO)的底物结合口袋被重塑，以进一步定向提高催化活性和热稳定性以产生内酯。用PAMO中的外源α-螺旋取代底物结合口袋中的环，构建了突变体OgBVMO-Re。值得注意的是，柔性环的替换导致所测试的支环酮的活性显著增加(1-6.4倍)，并导致OgBVMO-Re的热稳定性明显改善(t1/2(45°C)从30分钟到60分钟)。MD模拟表明，改造底物结合口袋可以在一定程度上影响局部残基相互作用网络、底物结合口袋的比表面积和体积以及亲核攻击距离，这是OgBVMO具有较高催化活性的部分原因，通过改变局部二级结构来调节表面性质可以提高OgBVMO的热稳定性。![]()
图8.OgBVMO-WT和OgBVMO-Re催化2-丙基环己酮的时间历程曲线。实验条件保持如下：2μmol L−1野生型或突变型酶的，包含各自底物的5 mmol L−1，NADPH的1 mmol L−1,50 mmol L−1的磷酸盐缓冲液（pH 8.5）。反应在30°C的玻璃瓶中进行，以500 rpm持续搅拌。实验分3个重复进行，数据代表平均±标准差。
综上所述，本研究为提高BVMOS的催化活性和热稳定性提供了一条有效途径，为促进BVMOS高效制备内酯奠定了坚实的基础。此外，的工作表明，底物结合口袋中的二级结构对催化活性和热稳定性起着至关重要的作用。此外，它还揭示了重塑结合口袋为获得理想的酶性质提供了一种可行的策略。
原文：Simultaneously Enhanced Catalytic Activity and Thermostability of a Baeyer−Villiger Monooxygenase from Oceanicola granulosus by Reshaping the Binding PocketDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c02395
