芯片器官（OOC）微流体培养技术已成为一个强大的平台，用于可控地模拟旁分泌信号传导的时空动态。设计了一种心脏纤维化芯片模型，采用共培养的人类心脏成纤维细胞和配备活力测量功能的多能干细胞衍生的心肌细胞。因此，迫切需要开发 OOC 模型来阐明关键信号通路并发现与巨噬细胞介导的心脏免疫学相关的潜在药物。
2024年11月13日，北京大学药学院天然药物与仿生药物国家重点实验室姜勇教授团队在Acta Pharmaceutica Sinica B发表题为“A microfluidic coculture model for mapping signaling perturbations and precise drug screening against macrophage-mediated dynamic myocardial injury”的文章。开发了一种微流控模型来促进巨噬细胞和心肌细胞的共培养，从而可以映射关键信号通路和筛选针对炎症诱导的动态心肌损伤的潜在治疗药物。建立了一种整合筛选策略来精确筛选生物活性天然产物，并在体外和体内鉴定了人参皂苷Rb1和原儿茶酚醛具有潜在的心脏保护作用。
摘要
巨噬细胞介导的炎症在心血管疾病的发病机制中起着重要作用。然而，目前基于细胞的模型对巨噬细胞和心肌细胞之间的相互作用缺乏全面的了解，阻碍了有效的治疗干预措施的发现。在此，我们开发了一种微流控模型来促进巨噬细胞和心肌细胞的共培养，从而可以映射关键信号通路和筛选针对炎症诱导的动态心肌损伤的潜在治疗药物。通过代谢谱和生物信息学富集分析，具有动态细胞-细胞交互作用的芯片模型揭示了炎症和氧化应激相关代谢通路的稳健激活，与人类和啮齿类动物心肌梗死的代谢谱非常相似。此外，我们建立了一种整合筛选策略来精确筛选生物活性天然产物，并在体外和体内鉴定了人参皂苷Rb1和原儿茶酚醛具有潜在的心脏保护作用。综上所述，微流控共培养模型促进了对巨噬细胞介导的心脏免疫机制的认识，并可能加速发现心肌损伤的治疗方法。
1 .芯片上炎症诱发的心肌损伤模型
在健康的心脏中，巨噬细胞是最丰富的免疫细胞，约占总细胞群的 10%。在心脏损伤期间，巨噬细胞的数量会显著增加，从而在与 CVD 相关的炎症级联中发挥关键作用（图 1 A）。它们的激活会释放大量炎症介质，导致心肌损伤。为了复制激活的巨噬细胞和心肌细胞之间的实时通信，我们开发了一种包含8个结构单元的共培养微流控芯片（图1B）。该芯片的单元间距为 13.5 mm，与液体分配器、酶标仪和高内涵成像设备等高通量设备兼容。每个单元包含两个通道和多个连接凹槽（图1 C）。我们采用软光刻技术进行微芯片制造，8单元的设计受到3英寸硅片尺寸的限制。改用注射成型进行芯片生产可以进一步提高产量。主通道用于培养心肌细胞，侧通道容纳巨噬细胞（图1D）。侧通道的宽度是主通道的三倍，以确保有足够的空间培养活化的巨噬细胞以刺激心肌细胞。
首次在微流控芯片上建立炎症性心脏损伤模型。分别将激活的巨噬细胞或对照巨噬细胞与心肌细胞实时共培养为模型组（Chip Model）或对照组（Chip Ctrl）。模型组心肌细胞活力下降约10.7%，表现为红色荧光增加和形态皱缩（图1E）。此外，使用核DNA染色剂Hoechst 33324对心肌细胞凋亡进行表征。在模型组中，心肌细胞表现出更亮的蓝色荧光，表明凋亡百分比较高，为21.8%（图1F）。
图1 芯片上炎症诱发的心肌损伤模型
2 .代谢组水平芯片模型上炎症诱发心肌损伤动力学的仿生特征及病理机制
基于LC-MS/MS的代谢组学分析如下：（1）模型组（Chip Model）和对照组（Chip Ctrl）微流控芯片的细胞裂解物；(2)模型组(CM Model)和对照组(CM Ctrl)条件培养基的细胞裂解液；(3) ISO组(ISO)和生理盐水对照组(Saline)大鼠的心脏组织；(4)LAD结扎组(LAD)和假手术对照组(Sham)大鼠心脏组织；(5)来自AMI患者组(AMI)和健康对照组(Health)的人类血液(图2A )。五个可比组（1-5）之间的差异代谢物列于图2B和C。在图2D中，我们计算并描绘了一个基于倍变的热图，该热图显示了芯片模型、CM模型、MI大鼠和AMI患者中发现的改变代谢物的变化趋势。值得注意的是，Chip模型上观察到的大多数代谢物变化与MI大鼠（ISO， LAD）和AMI患者更相似，Chip模型显示出更多的显著变化的代谢物（fdr校正P值< 0.05）。在AMI患者中，我们的结果显示循环炎症相关代谢物显著升高，包括花生四烯酸及其氧化衍生物（12-HETE、5-HETE、20-HETE、白三烯B4）和溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）（图2C）。有趣的是，芯片模型上的这些促炎代谢物表现出更接近于人类样本（AMI患者），而不是大鼠样本（ISO和LAD）。
利用MetaboAnalyst和IPA进行通路富集分析，以确定差异代谢物所涉及的关键代谢通路和生物学功能。与CM模型相比，Chip模型上富集的代谢通路与在大鼠和人类中观察到的代谢通路非常相似，尤其是在炎症和氧化应激过程中（图2E）。综上所述，在代谢组学水平上，我们的研究结果证明了Chip模型忠实地复制了与炎症和氧化应激相关的体内病理机制。
图2 .不同组间代谢物和代谢途径数据集的比较
3. Chip模型上炎症和氧化应激通路的激活
基于代谢组学的研究结果，芯片模型上心肌损伤动力学的关键代谢途径如图3A所示。关于代谢谱的病理生理机制的假设通过分子生物学得到了进一步验证。首先，在芯片模型上检测炎症相关分子的表达。模型组炎症相关基因（ COX-2、Alox15、CYP1B1和NF-κB ）的相对表达水平显著升高（图3B）。此外，与对照组相比，模型组炎症介质（NO、TNF- α和IL-6）的释放显著升高（图3C）。此外，在芯片模型的共培养条件下，这些炎症细胞因子的表达水平随着时间的推移逐渐增加，与 MI 的病理过程一致，其中招募和驻留的巨噬细胞在体内持续释放炎症细胞因子（图 3D）。因此，芯片模型和CM模型中炎症通路均被激活。然而，它在芯片模型中更为明显。
接下来，验证了芯片模型上氧化应激水平的上调。与对照组相比，模型组中 DHE 的红色荧光显著增加，表明 ROS 的存在升高。芯片模型上ROS阳性细胞的百分比达到56.6%（图3E和F）。相反，模型组绿色荧光的减少表明关键抗氧化酶SOD2的表达减少（图3G)，反映出抗氧化防御机制的显著缺陷。此外，使用 JC-1 染色评估了芯片模型上心肌细胞的线粒体膜电位。与对照组相比，模型组中线粒体去极化（绿色荧光）的细胞数量显著增加（图3H）。这些结果表明，氧化应激途径仅在芯片模型上被激活，从而导致线粒体功能的破坏。
因此，与CM模型相比，巨噬细胞和心肌细胞之间动态相互作用的芯片模型更高程度地激活炎症和氧化应激通路。这更类似于临床环境中观察到的心肌损伤的代谢特征。
图3 .芯片模型上炎症和氧化应激途径的激活
4 .有效发现生物活性天然产物的综合筛选策略
基于上述两种模型的独特特征，我们提出了一种综合筛选策略，以发现抗炎症引起的心肌损伤的生物活性天然产物（图4A）。在初步筛选中，73种天然产物中的5种在CM模型上被高通量鉴定为具有生物活性，包括20( S )-人参皂苷Rg 2、甘草酸、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb 1和原儿茶醛。与模型组相比，这些天然产物使心肌细胞的活力分别从58.0%显著提高至77.0%、81.7%、88.3%、81.5%和96.8%（图4B）。在芯片模型上二次筛选进一步确定了这五种天然产物的功效，发现只有人参皂苷Rb1和原儿茶醛显著增加了心肌细胞的活力，更多的活细胞被染成绿色，更少的死细胞被染成红色（图4C和D）。考虑到与 CM 模型相比，芯片模型更接近于在患者和啮齿动物中观察到的关键病理机制，因此芯片模型有望提高筛查的准确性。
图4 .通过综合筛选策略发现具有生物活性的天然产物
5 .天然产物的体内心脏保护活性
为了进一步测试所开发模型的可靠性，我们研究了五种天然产物在治疗小鼠 ISO 诱导的 AMI 中的功效。ISO治疗组的CK-MB和乳酸LDH水平显著升高，坏死区域变大并有炎症细胞浸润，ROS水平升高，表明心肌损伤（图5）。胃内给予人参皂苷Rb 1和原儿茶醛可显著降低血清中CK-MB和LDH的水平，表明它们在体内具有心脏保护活性（图5A和B）。然而，其余三种天然产物（20( S )-人参皂苷 Rg 2组、甘草酸组和人参皂苷Rd)对心肌损伤没有表现出治疗作用。与ISO处理组相比，所有五种天然产物均表现出不同程度的排列紊乱、组织坏死和炎症浸润减少。值得注意的是，人参皂苷 Rb 1和原儿茶醛在抑制炎症浸润方面表现出卓越的功效（图 5 C）。此外，人参皂苷Rb 1和原儿茶醛分别显著降低ROS阳性率至18.0%和21.3%，而其余三种天然产物对氧化应激没有抑制作用（图5D和E）。因此，体内结果表明，只有在芯片模型上被鉴定为具有生物活性的人参皂苷 Rb 1和原儿茶醛可以预防心肌损伤。相比之下，CM 模型上发现的其他三种天然产品都是误报。综合筛选策略在通量和准确性之间取得了良好的平衡，提高了体内药效评价的成功率。
图5 .天然产物对 ISO 诱导的小鼠 AMI 的影响
结论
总之，我们引入了巨噬细胞介导的心肌损伤的微流体共培养模型，用于机制研究和治疗发现。微芯片模型可以对激活的巨噬细胞和心肌细胞之间的动态串扰进行建模。我们的研究结果揭示了芯片模型中炎症和氧化应激途径的显著激活，反映了 AMI 和 MI 模型大鼠患者的临床代谢组学观察结果。促炎介质的释放进一步证明动态旁分泌信号在介导炎症引起的心肌损伤中发挥着关键作用。使用芯片模型，我们鉴定了两种天然产物：人参皂苷 Rb 1和原儿茶醛，它们在体内表现出心脏保护活性同时消除误报。微芯片模型是对传统细胞培养和动物模型的重要且可行的补充，并为识别对人类患者具有更高转化相关性的潜在治疗方法提供了快速通道。因此，我们的芯片模型增强了对疾病进展的理解，并有助于识别影响疾病结果的关键因素。此外，它能够在受控和动态的微环境中评估药物反应，从而有可能更准确地预测药物功效并简化药物发现过程。
一种再现巨噬细胞介导的心肌损伤的微流控模型揭示了反映患者代谢特征的激活的炎症和氧化通路。人参皂苷Rb1和原儿茶酚醛具有预防心肌损伤的作用。
Gao Z, Du Z, Hou Y, Hua K, Tu P, Ai X, Jiang Y. A microfluidic coculture model for mapping signaling perturbations and precise drug screening against macrophage-mediated dynamic myocardial injury. Acta Pharm Sin B. 2024 Dec;14(12):5393-5406. doi: 10.1016/j.apsb.2024.11.004.
