•RARγ低表达的tams在CRC中具有致癌功能
•肿瘤源性乳酸通过组蛋白乳酸化抑制巨噬细胞RARγ的表达
•RARγ调节TRAF6-IL-6-STAT3信号通路来连接炎症和肿瘤发生
•去甲二氢愈创木酸通过靶向RARγ有效地展示抗肿瘤作用
摘要
巨噬细胞在肿瘤微环境（TME）中具有表型和功能的多样性。然而，如何将巨噬细胞重塑为肿瘤表型，以及如何将其用于治疗仍有待探索。在这里，我们发现在TME中，RARγ在巨噬细胞中表达下调，并且其表达与结直肠癌（CRC）患者的不良预后相关。在巨噬细胞中，RARγ与肿瘤坏死因子受体相关因子6 （tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6）相互作用，阻止TRAF6的寡聚化和自泛素化，从而抑制核因子κB信号传导。然而，在巨噬细胞中，肿瘤来源的乳酸促进H3K18乳糖化，从而抑制RARγ基因的转录，从而提高TME中白细胞介素-6 （IL-6）的水平，并通过激活CRC细胞中的信号转导和转录激活因子3 （STAT3）信号赋予巨噬细胞促肿瘤功能。我们发现去甲二氢愈创木酸（NDGA）通过直接结合RARγ抑制TRAF6-IL-6-STAT3信号通路发挥有效的抗肿瘤作用。本研究揭示了乳酸驱动的巨噬细胞功能重塑通过抑制RARγ表达，并强调NDGA作为治疗CRC的候选化合物。
1.巨噬细胞中RARγ表达下调与结直肠癌患者的不良预后相关
图1 RARγ在巨噬细胞中下调，并预测不良临床结局
2.肿瘤源性乳酸通过组蛋白乳糖化抑制巨噬细胞RARγ基因转录
为了确定导致巨噬细胞中RARγ表达降低的潜在机制，我们使用基于transwell的共培养系统将巨噬细胞与CRC细胞共培养（图2A）。结果表明，当这些细胞与CRC细胞共培养时，骨髓来源的巨噬细胞（BM-Mφs）和人单核细胞THP1细胞中的RARγ mRNA水平均被强烈抑制（图2B）。代谢重编程已成为一种常见且基本的癌症特征。肿瘤细胞表现出葡萄糖摄取增加，从而在TME中产生大量乳酸，从而促进肿瘤生长。为了测试乳酸是否导致巨噬细胞中RARγ表达降低，我们在CRC细胞的培养基中添加了糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG），以抑制乳酸生成（图2C），发现抑制CRC细胞中的乳酸生成可显著上调巨噬细胞RARγ的表达（图2D）。与此一致的是，敲除乳酸脱氢酶LDHA基因部分抑制了MC38细胞中乳酸的产生（图2E），这显著增加了共培养体系中BM-Mφs中RARγ的表达（图2F）。相反，在BM-Mφs的培养基中添加外源性乳酸可显著抑制RARγ的表达（图2G）。综上所述，这些结果表明TME中肿瘤来源的乳酸至少部分地导致了巨噬细胞RARγ的下调。
乳化是代谢物衍生的组蛋白修饰，已被确定为一种直接调控染色质基因转录的表观遗传修饰。接下来，我们探讨了组蛋白乳糖化是否是乳酸抑制RARγ表达的潜在机制。乳酸处理BM-Mφs显著上调了H3K18la水平，但降低了RARγ的表达（图2H）。流式细胞术分析进一步证实，与对照组相比，来自ldha清除肿瘤的巨噬细胞表现出H3K18la水平降低和RARγ表达增加（图2I和2J）。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）结合实时荧光定量PCR (qPCR)，我们发现H3K18la显著富集在RARγ基因的启动子区域；然而，在MC38细胞中，通过2-DG处理或沉默LDHA来抑制乳酸生成大大降低了H3K18la在RARγ启动子区域的富集（图2K和2L）。为了证实RARγ表达的抑制是由于TME中的组蛋白乳糖化，我们将BM-Mφs与经或未经C646处理的MC38肿瘤细胞共培养，我们发现C646显著降低了BM-Mφs中的H3K18la水平，但增加了RARγ的表达（图2M）。C646是乙酰转移酶p300的抑制剂，已被确定为潜在的组蛋白Kla书写者23。总之，这些发现提示，TME中累积的肿瘤源性乳酸足以通过H3K18la抑制RARγ基因从染色质转录（图2N）。
图2 H3K18乳糖化导致巨噬细胞中RARγ表达下调
3.缺乏RARγ的单核/巨噬细胞迁移能力增强，促进肿瘤生长
为了研究巨噬细胞RARγ对肿瘤发展的影响，我们首先使用慢病毒载体构建了稳定过表达RARγ和绿色荧光蛋白（GFP）的THP1细胞株（THP-1/OE/RARγ）。随后建立裸鼠皮下移植瘤模型。接种肿瘤细胞2天后，通过尾静脉将THP-1/OE/RARγ或THP1/control细胞注射到小鼠体内（图3A）。我们的结果表明，THP1细胞中RARγ的过表达显著抑制了肿瘤的生长，与对照组相比，THP1/OE/RARγ处理的小鼠的肿瘤重量下降（图3B）和体积较小（图3C）证明了这一点。为了进一步证实巨噬细胞中RARγ缺失对肿瘤细胞生长的影响，我们将gfp标记的稳定表达RARγ shRNA （shRNA/RARγ）或对照shRNA （shRNA/control）的THP1细胞静脉注射到小鼠尾部。与shRNA/control组相比，THP1/shRNA/RARγ沉默组（THP1/shRNA/RARγ）肿瘤生长明显增强，表现为肿瘤体积和重量显著增加（图3D-3F）。
流式细胞术分析进一步证实，来自THP1/OE/ rar γ处理小鼠的肿瘤中，浸润的GFP+ THP1细胞数量减少（图3G）。然而，在THP1/shRNA/ rar γ处理的小鼠中，浸润肿瘤组织的GFP+ THP1细胞明显多于THP1/shRNA/对照处理的小鼠（图3H）。与这些结果一致，体外Transwell细胞迁移分析表明，THP1细胞中RARγ的过表达显著降低了THP1细胞对肿瘤细胞的趋化（图3I），而THP1细胞中RARγ的缺失大大增强了它们对肿瘤细胞的趋化（图3J），这表明单核/巨噬细胞中RARγ的缺失促进了它们向肿瘤组织的迁移能力。既往研究表明，单核/巨噬细胞中的CC趋化因子受体（ccr）和集落刺激因子-1受体（CSF-1R）在生存、增殖和运动中发挥关键作用，并促进肿瘤进展。为了深入了解RARγ如何影响单核/巨噬细胞向肿瘤细胞的趋化，我们使用qPCR分析了THP1细胞中ccr和CSF-1R的表达。如图3K和3L所示，THP1细胞中过表达RARγ显著抑制了CSF-1R的表达（图3K），而THP1细胞中沉默RARγ则显著增强了CSF-1R的表达（图3L）。随后，我们试图确定CSF-1R在单核/巨噬细胞迁移中的作用。有趣的是，使用CSF-1R特异性抗体阻断CSF-1R功能显著削弱了THP1细胞的迁移能力（图3M），这表明CSF-1R介导单核细胞/巨噬细胞的迁移。
图3 单核/巨噬细胞RARγ调节其迁移能力并介导CRC肿瘤生长
4.巨噬细胞中RARγ的缺失可激活CRC细胞中的STAT3信号
然后，我们研究了rar γ敲除巨噬细胞加速肿瘤生长的潜在机制。首先，我们从稳定表达对照shRNA （shRNA/control）的THP1细胞中收集条件培养基（CM0），从稳定沉默RARγ的THP1细胞中收集条件培养基（CM1或CM2），随后我们培养CRC细胞（图4A和4B）。结果显示，与CM0相比，CM1或CM2处理后CRC细胞中磷酸化STAT3 （pSTAT3）的水平显著升高（图4C）。磷酸化的STAT3从细胞质转位到细胞核中，作为转录激活因子调节靶基因的表达。根据分离实验的结果，与CM0条件培养基相比，CM1和CM2显著增加了SW480细胞中STAT3的核定位（图4D）。免疫荧光（IF）染色显示，条件培养基CM1处理的CRC细胞显著促进了STAT3的核转位（图4E）。我们进一步研究了STAT3的转录活性和靶基因的表达。我们的结果表明，CM1和CM2显著增加了stat3介导的报告基因活性（图4F）。qPCR检测结果显示，条件培养基CM1和CM2显著提高了SW480细胞中4个经典STAT3靶基因BIRC5、IL17A、c-Myc和VEGF的mRNA表达水平（图4G）。与此同时，人类CRC组织中RARγ表达的代表性图像如图4H所示。我们发现间质CD68+巨噬细胞中RARγ的低表达（RARγlow）与肿瘤细胞中pSTAT3的高水平具有显著的相关性（图4I）。Spearman秩相关分析证实，巨噬细胞中的RARγ表达与肿瘤细胞中的pSTAT3表达呈显著负相关（图4J）。综上所述，这些结果表明巨噬细胞中RARγ的缺失激活了STAT3信号通路，从而促进了TME中肿瘤的生长。
CM2显著促进了从新鲜人结肠癌组织中分离出的肿瘤类器官的形成，而il -6中和抗体大大抑制了这一过程（图4K）。免疫荧光数据表明，il -6中和抗体治疗减弱了CM2诱导的肿瘤类器官中STAT3的核定位（图4L）。总之，这些结果表明IL-6在激活STAT3和类器官形成中的作用。
图4巨噬细胞中RARγ缺陷激活CRC细胞和人CRC肿瘤类器官中的STAT3信号传导
5.巨噬细胞中RARγ与TRAF6相互作用抑制NF-κB信号通路
越来越多的证据表明，TNF受体相关因子6 （TRAF6）在激活NF-κB调节炎症相关癌症（包括crc）中起关键作用。因此，我们评估了RARγ是否通过与TRAF6的相互作用调节NF-κB信号传导。免疫共沉淀（CoIP）分析表明，内源性和外源性RARγ均与TRAF6相互作用（图5A和5B）。重组GST-TRAF6（而非GST）直接结合Strep-RARγ/LBD，表明RARγ和TRAF6之间存在直接相互作用（图5C）。此外，我们对RARγ和TRAF6之间的相互作用进行了计算建模，结果表明，RARγ-TRAF6复合体可以通过RARγ的LBD结构域和TRAF6的TRAF-N结构域相互作用（图5D，顶部）。RARγ的LBD结构域的残基P320-D324负责与TRAF6的相互作用（图5D，底部）。重要的是，丙氨酸扫描显示322位的谷氨酸残基被丙氨酸取代极大地损害了复合物的稳定性（图5E），这表明RARγ的LBD区域的E322残基是其结合TRAF6的能力所必需的。CoIP实验进一步证实，突变型RARγ/E322A失去了与TRAF6结合的能力（图5F），并且未能在细胞中与TRAF6共定位（图5G）。
TRAF6的TRAF-N结构域是其自身泛素化和NF-κB信号通路激活所必需的；因此，我们研究了TRAF6- n区域的RARγ与TRAF6的相互作用是否调节TRAF6自泛素化。我们的结果表明，TRAF6的自泛素化被LPS强烈诱导（图5H），RARγ过表达以剂量依赖性方式显著抑制lps诱导的TRAF6自泛素化（图5H）。相反，沉默RARγ进一步增强了lps诱导的TRAF6自泛素化（图5I）。TRAF6的寡聚化是其自身泛素化的原因32我们的结果表明，RARγ沉默大大增强了TRAF6的寡聚化（图5J），而RARγ过表达则剂量依赖性地抑制了TRAF6的寡聚化（图5K）。总之，这些结果表明，RARγ与TRAF6相互作用，从而抑制巨噬细胞内的NF-κB活化和IL-6生成，从而减弱肿瘤细胞内的STAT3信号传导（图5L）。
图5 巨噬细胞中RARγ与TRAF6的相互作用
6.NDGA直接结合RARγ抑制TRAF6-IL-6-STAT3信号通路并抑制CRC生长
我们的上述发现为通过RARγ开发与炎症相关的CRC的特异性药物治疗提供了机会。为此，我们采用了一种基于结构的分级虚拟筛选方法，从天然和生物活性化合物库（包括5,913种化合物）中筛选潜在的RARγ配体（图6A）。根据化合物的结合能，选择前10个化合物进行生物学评价。最终，我们通过基于表面等离子体共振（SPR）的实验发现，从三叉木中提取的一种酚类木脂素NDGA与RARγ直接结合，并呈剂量依赖性，KD值为11.28 μM（图6B）。因此，NDGA剂量依赖性地抑制ATRA （RARγ的经典配体）诱导的Gal4-DBD-RARγ-LBD反式激活（图6C）。此外，细胞热位移分析（CETSA）表明，与DMSO相比，NDGA增加了RARγ的热稳定性（图6D）。这些结果表明NDGA与RARγ直接结合。
为了进一步验证NDGA的结合稳定性并优化其结合位姿，我们进行了500 ns的全原子分子动力学模拟。通过分析MD模拟轨迹，我们发现在模拟开始时，NDGA分子是直线结合的，NDGA与E403和C237之间的两个氢键在结合口袋中稳定。在80 ns左右，NDGA的结合构象发生变化，分子构象发生弯曲，NDGA与C237之间的氢键断裂，NDGA与A302之间形成新的氢键（图6E）。NDGA和相互作用残基的演化时间表明，在剩余的MD模拟中，NDGA与A302、G303、R396和E403之间的氢键稳定了复合物的构象（图6F）。在氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎性结肠癌小鼠模型（图6G）中，与给药PBS相比，向C57BL/6小鼠投与NDGA不影响体重（图6H）。然而，NDGA显示出显著降低的肿瘤负荷，表现为更少的肿瘤数量和更小的肿瘤大小（图6I和6J）。NDGA的强效抗肿瘤作用与抑制IL-6-STAT3信号通路相关，在小鼠中给予NDGA显著降低了血清中的TNFα和IL-6水平（图6K），并显著抑制了肠肿瘤组织中的STAT3磷酸化（图6L）。机制上，NDGA促进了巨噬细胞中RARγ与TRAF6的相互作用（图6M），并抑制了TRAF6的寡聚化和自泛素化（图6N和6O）。综上所述，这些结果表明NDGA通过抑制TME中TRAF6-IL-6-STAT3信号通路来靶向巨噬细胞RARγ发挥抗肿瘤作用。
图6 NDGA通过靶向RARγ抑制TRAF6-IL-6-STAT3信号通路从而抑制肿瘤生长
结论
综上所述，我们的结果强调了乳化驱动的RARγ下调对巨噬细胞的促炎和肿瘤表型的重要性，并揭示了在TME中激活TRAF6-IL-6-STAT3信号通路的一个之前未发现的机制。我们的研究还确定了NDGA是一种有前景的抗肿瘤药物，靶向RARγ治疗炎症相关的CRC。
Li XM, Yang Y, Jiang FQ, Hu G, Wan S, Yan WY, He XS, Xiao F, Yang XM, Guo X, Lu JH, Yang XQ, Chen JJ, Ye WL, Liu Y, He K, Duan HX, Zhou YJ, Gan WJ, Liu F, Wu H. Histone lactylation inhibits RARγ expression in macrophages to promote colorectal tumorigenesis through activation of TRAF6-IL-6-STAT3 signaling. Cell Rep. 2024 Feb 27;43(2):113688. doi: 10.1016/j.celrep.2024.113688.
