传统中药（TCM）因其副作用小且疗效高而被用作治疗癌症的有效方法已有数百年历史。大量证据支持多种源自中药的天然产物具有抗癌特性，包括白藜芦醇、芹菜素、木犀草素、姜黄素和 pritimerin。在这些化合物中，pritimerin，一种天然醌甲基化物三萜类化合物，已证明具有广泛的生物效应，例如抗炎、抗菌、抗真菌、和抗肿瘤活性。值得注意的是，最近的研究揭示了 pritimerin 作为针对各种类型肿瘤的抗癌剂的潜力。例如，pritimerin 通过抑制炎症反应和 Wnt/β-catenin 通路对结直肠癌具有抑制作用。此外，它还可以通过抑制蛋白激酶B途径来克服BCa细胞的耐药性，并诱导食管癌细胞凋亡和自噬。然而，Pritimerin 在 TNBC 中的精确功能和潜在作用机制在很大程度上仍未被探索。
2025年1月15日，香港浸会大学中医学院吕爱平联合南方医科大学管道刚在Adv Sci发表题为“Pristimerin Promotes Ubiquitination of HSPA8 and Activates the VAV1/ERK Pathway to Suppress TNBC Proliferation”的文章。pristimerin显著抑制TNBC细胞的迁移和侵袭，并增强TNBC细胞对阿霉素的敏感性。药物亲和反应靶点稳定性和质谱技术确定pristimerin的直接结合靶点。机制上，pristimerin促进HSPA8的泛素化和降解，导致HSPA8的下游客户蛋白Vac鸟嘌呤核苷酸交换因子1 （VAV1）的降解减少，VAV1在激活ERK通路中起重要作用。
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种预后较差的乳腺癌亚型。天然化合物pristimerin具有良好的抗肿瘤作用。在本研究中，我们发现pristimerin在TNBC中显著触发自噬启动和诱导凋亡。机制上，RNA测序显示pristimerin激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（MAPK/ERK）通路。采用药物亲和反应靶点稳定性和质谱技术确定pristimerin的直接结合靶点。热休克蛋白家族A成员8 （HSPA8）是通过细胞热位移实验和表面等离子共振实验进行鉴定和验证的。进一步的结果表明，pristimerin促进HSPA8的泛素化和降解，导致HSPA8的下游客户蛋白Vac鸟嘌呤核苷酸交换因子1 （VAV1）的降解减少，VAV1在激活ERK通路中起重要作用。重要的是，敲低HSPA8或VAV1显著降低了pristimerin对TNBC细胞的抗癌活性。此外，pristimerin显著抑制TNBC细胞的迁移和侵袭，并增强TNBC细胞对阿霉素的敏感性。综上所述，本研究初步证明pristimerin直接靶向HSPA8激活VAV1/ERK通路，从而促进细胞自噬和凋亡。
1. Pristimerin抑制TNBC细胞增殖并诱导细胞凋亡
Pristimerin 是一种天然存在的醌甲基三萜类化合物，被确定为 TNBC 发展的潜在抑制剂（图 1A）。为了评估pritimerin对TNBC细胞增殖的影响，将不同浓度的pritimerin给予MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞长达5天，然后通过细胞计数试剂盒8测试相对细胞活力(CCK-8)试剂。结果表明，pritimerin 以时间和浓度依赖性方式有效抑制 TNBC 细胞增殖（图 1B）。此外，集落形成测定的结果显示，Pritimerin处理后TNBC细胞克隆的数量显著减少（图 1C））。此外，5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）染色结果显示，经过pritimerin处理后，用红色荧光染料EdU标记的新合成DNA的数量逐渐减少（图 1D）。细胞周期蛋白 B1 表达（图 1F）。总的来说，这些结果证明了 pritimerin 对 TNBC 细胞增殖能力的抑制作用。考虑到pritimerin的显著抑制作用，我们研究了其对TNBC细胞凋亡的影响。采用流式细胞术和Hochest 33342染色法评估TNBC细胞的凋亡率。如图 1E所示，pritimerin 治疗显著增加了 TNBC 细胞的凋亡。此外，pritimerin处理导致促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bax）、裂解聚ADP核糖聚合酶（PARP）和裂解caspase-3的表达升高，而抗凋亡蛋白B的表达降低-细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)（图 1G）。总体而言，我们的结果强调了 pritimerin 在 TNBC 增殖中的显著抗癌功效。
图1 Pristimerin 抑制 TNBC 细胞增殖并诱导细胞凋亡
2 自噬有助于Pristimerin在TNBC中的抗肿瘤活性
在这里，我们想研究 pritimerin 诱导的 TNBC 细胞凋亡是否与自噬相关。因此，使用GFP-RFP-LC3慢病毒感染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，观察早期自噬体（黄色点，GFP +和 RFP +）和晚期自噬溶酶体（红色点，GFP - 和 RFP +）的分布。共聚焦结果表明，Pritimerin 处理后早期自噬体和晚期自噬体均显著增加（图 2A）。更重要的是，透射电子显微镜（TEM）图像显示用pritimerin处理24小时后有更多的自噬空泡（图 2B）。此外，蛋白质印迹分析表明，pritimerin促进LC3-I向LC3-II的转化，同时以浓度依赖性方式降低sequestosome 1 (p62)的表达（图 2C）。总之，这些发现强烈表明 pritimerin 刺激了 TNBC 细胞中自噬体的积累。Baf-A1 治疗显著减弱 pritimerin 诱导的 TNBC 细胞凋亡（图 2D、E）。综上所述，pritimerin通过激活细胞自噬发挥其抗肿瘤活性。鉴于自噬是一个包含多个步骤的动态过程，我们采用了两种自噬抑制剂来进一步研究该过程。第一个抑制剂是氯喹（CQ），它是一种晚期自噬抑制剂。它的作用是阻止自噬体与溶酶体的融合，从而阻止自噬体的降解。因此，如果自噬启动被激活，CQ对自噬的阻断将导致LC3斑点的进一步积累。第二种抑制剂是3-甲基腺嘌呤（3-MA），一种早期自噬抑制剂，可以抑制自噬的初始激活。如图 2F，我们观察到，在用 CQ 阻断自噬体降解后，用 pritimerin 治疗会导致 LC3 斑点增加。然而，当用3-MA抑制早期自噬时，pritimerin不会促进LC3斑点的形成。这些发现表明，pritimerin诱导TNBC细胞中自噬体的积累是由于自噬起始阶段的激活，而不是自噬降解阶段的阻断。
图2 自噬有助于 TNBC 中 pritimerin 的抗肿瘤活性
3 Pristimerin通过激活MAPK/ERK通路诱导自噬
为了阐明 pritimerin 诱导细胞自噬的潜在机制，我们通过 RNA 测序 (RNA-seq) 比较了 pritimerin 或 DMSO 处理 48 小时的 MDA-MB-231 细胞的转录表达谱。当差异倍数阈值设置为1.5时，总共生成了973个差异表达基因（DEG），其中636个上调，337个下调（图 3A）。为了进一步研究所涉及的潜在途径，我们进行了KEGG富集分析，发现了MAPK途径的参与，这是已知与细胞自噬相关的经典途径（图 3B）。因此，我们检测到 MAPK 通路内三个经典通路的激活。值得注意的是，pritimerin治疗显着激活了ERK MAPK通路，p-ERK表达显着上调证明了这一点，而c-Jun N末端激酶（JNK）和p-38 MAPK通路不受影响（图 3C）。为了验证 pritimerin 诱导的自噬细胞死亡确实是通过 ERK MAPK 通路的激活来调节的，我们应用了 ERK 通路抑制剂 U0126。正如预期的那样，U0126 对 ERK 通路的抑制部分抵消了 pritimerin 的抗癌活性，细胞增殖能力恢复和细胞凋亡率降低就证明了这一点（图 3D-F）。此外，Pritimerin处理后显着增加的LC3点状聚集也随着U0126的添加而部分减少（图 3G）。这些发现提供了令人信服的证据，证明 ERK 通路的激活在普里蒂莫林诱导的自噬细胞死亡机制中发挥着关键作用。
图3.Pristimerin 通过激活 ERK 通路诱导自噬
4 Pristimerin直接靶向HSPA8
药物亲和反应靶稳定性（DARTS）是一种基于小分子药物与靶蛋白结合可以降低这些蛋白对蛋白酶降解的敏感性的原理而开发的新技术。该技术广泛应用于药物筛选和靶标识别。在本研究中，采用 DARTS-MS 技术来揭示普斯蒂莫林的直接靶点，如图4A 所示。质谱分析结果揭示了 67 种可能作为普里斯蒂莫林靶标的蛋白质。采用细胞热位移测定（CETSA）来检测药物与靶蛋白的结合。结果显示pritimerin仅增强HSPA8对热变性的抵抗力，而对TRPM2蛋白没有影响（图 4B）。值得注意的是，表面等离子共振（SPR）实验表明pritimerin和HSPA8蛋白之间具有显著的结合亲和力，解离常数（KD）为3.4×10 -8（阿霉素和多西紫杉醇作为阴性对照）（图 4C，D）。此外，分子对接的结果表明pritimerin有可能与HSPA8的丝氨酸432（SER-432）残基形成氢键（图 4E）。因此，我们构建了HSPA8 S432A -Flag突变质粒【Substitution of SER-432 (S) for alanine-432 (A)】并测试外源突变蛋白HSPA8 S432A之间的结合。这些观察结果强烈表明 pritimerin 和 HSPA8 蛋白之间存在直接相互作用。
HSAP8 已被确定为参与多种致癌过程（例如结肠癌、神经胶质瘤和子宫内膜癌）的客户蛋白的调节剂。虽然 HSPA8 已被建议作为 TNBC 的潜在预后指标，但其在 TNBC 中的具体作用仍不完全清楚。我们首先探讨了 HSPA8 在 BCa 中的表达。UALCAN网站上分析的TCGA数据库中HSPA8的表达表明，HSPA8在BCa和TNBC中表达上调（图 4F，H）。此外，bc-GenExMiner v5.0 是一款已发布的统计挖掘工具，专门用于分析带注释的 BCa 转录组数据（包括 DNA 微阵列 [ n = 11522] 和 RNA-seq [ n= 5023]）。结果显示，在所有DNA微阵列数据和DNA-seq数据中，HSPA8在TNBC中高表达（图 4G）。更重要的是，Kaplan-Meier生存分析证实，HSPA8高表达的患者比HSPA8低表达的患者生存期更短（图 4I）。qPCR 和 Western blot 结果还发现，与乳腺上皮细胞系 MCF10A 相比，TNBC 细胞中 HSPA8 的表达更高（图 4J，K）。
此外，我们建立了 HSPA8 敲低稳定细胞系（名为 shNC、shHSPA8-#1 和 shHSPA8-#2）和 HSPA8 过表达稳定细胞系（名为 OE-CON 和 OE-HSPA8），用于获得和丢失-功能测定。CCK-8和集落形成测定的结果表明，HSPA8的敲低显着抑制了TNBC细胞的增殖和集落形成，而HSPA8过表达显着增强了这些行为（图 4L-N）。此外，EdU染色显示HSPA8过表达增加了新合成的EdU标记DNA的量，表明TNBC细胞的细胞增殖能力显著增强（图 4O）。此外，我们构建了原位乳腺癌动物模型，结果证实HSPA8过表达促进了体内TNBC细胞的生长（图 4P，Q）。总而言之，我们的研究结果表明，HSPA8 有助于 TNBC 细胞的生长，而 pritimerin 直接靶向 HSPA8 蛋白。
图4 Pristimerin 直接针对 HSPA8
5 Pristimerin的抗癌活性依赖于HSPA8
我们假设 HSPA8 是 TNBC 中 pritimerin 诱导的自噬和细胞凋亡的直接靶标。为了验证这一假设，我们研究了 HSPA8 敲低条件下 pritimerin 处理对 TNBC 细胞自噬和增殖的影响。首先，我们检查了 HSPA8 表达的变化。Western blot结果显示，随着HSPA8敲低，pritimerin并没有进一步显著降低HSPA8的表达（图 5A）。然后，CCK-8 和集落形成测定表明 HSPA8 敲低部分减轻了 pritimerin 对细胞生长的抑制作用（图 5B，C）。此外，HSPA8敲低后，pritimerin诱导的早期自噬体和晚期自噬体水平升高显著降低（图 5C）。更重要的是，体内实验表明，当HSPA8表达下调时，TNBC肿瘤异种移植物对pritimerin的敏感性较低（图 5E，F）。总而言之，所有这些发现都表明 HSPA8 在 pritimerin 诱导的 TNBC 抑制中发挥着至关重要的作用。
图5 pritimerin 的抗癌活性依赖于 HSPA8
6 Pristimerin 减弱 HSPA8 介导的 VAV1 降解
为了进一步研究pritimerin激活ERK通路促进TNBC细胞自噬的分子机制，我们检测了pritimerin对HSPA8表达的影响。结果表明，pritimerin以剂量依赖性方式降低HSPA8的蛋白表达，而其转录水平不受影响（图 6A，B）。因此，我们推测pritimerin促进了HSPA8的降解。然后，我们用放线菌酮（CHX）处理TNBC细胞抑制蛋白质合成，并观察不同时间点（0、2、4和8小时）HSPA8蛋白的降解。结果表明，与 DMSO 组相比，pritimerin 处理显著加速了 HSPA8 的降解（图 6C）。以往的研究表明HSPA8是通过泛素-蛋白酶体途径降解的，而Hsc70-相互作用蛋白（CHIP）的羧基末端E3泛素连接酶参与介导这一过程，这鼓励我们研究HSPA8的泛素化程度。因此在接下来的实验中使用了MG132，一种蛋白酶体抑制剂，用于阻断26S蛋白酶体复合物的蛋白质水解活性。不出所料，我们的结果表明pritimerin促进泛素分子与HSPA8的结合，从而显著增强HSPA8的泛素化降解（图 6D）。此外，pritimerin处理显著增强了HSPA8对CHIP E3泛素连接酶的募集（图 6E）。总的来说，这些结果支持 pritimerin 促进 CHIP 介导的 HSPA8 蛋白酶体降解。
鉴于 HSPA8 在 CMA 中的关键作用，我们假设 pritimerin 通过抑制 HSPA8 表达来促进 ERK 通路激活，从而阻止客户蛋白的降解。为了确定参与此过程的 HSPA8 的潜在客户蛋白，我们进行了文献综述。我们发现VAV1是HSPA8的客户蛋白，它通过CMA途径被降解。VAV1 通过 VAV1 的 762-767 基序 (QFPFKE) 与 HSPA8 结合，这是一个维持 VAV1 蛋白降解水平的过程。即HSPA8调节VAV1的降解，并且它们的表达呈负相关。重要的是，VAV1 被认为是促进 ERK 通路激活的重要蛋白质。因此，我们首先验证了 HSPA8 和 VAV1 之间的表达。结果表明，HSPA8 敲低增加了 VAV1 的表达，而 HSPA8 过表达则降低了 VAV1 的表达（图 6F，G）。这表明HSPA8和VAV1之间呈负相关，这与HSPA8介导VAV1降解的结论一致。因此，我们接下来评估了 pritimerin 对 VAV1 蛋白表达的影响。正如预期的那样，pritimerin 以浓度依赖性方式抑制 VAV1 蛋白的降解（图 6H）。为了进一步证实 VAV1 蛋白在 pritimerin 诱导的抗癌活性中的关键作用，我们敲低 VAV1 表达以评估细胞活力。结果表明，Pritimerin 诱导的细胞增殖和集落形成抑制作用因 VAV1 敲低而部分减弱（图 6I）。总体而言，我们的研究结果表明，pritimerin 减弱了 HSPA8 介导的 VAV1 降解，进而促进了 ERK 通路激活。
图6 Pristimerin 可减弱 HSPA8 介导的 VAV1 降解
7 Pristimerin抑制TNBC细胞的迁移和侵袭
接下来，我们研究了pritimerin对TNBC细胞迁移和侵袭的影响。Transwell实验证明pritimerin对TNBC细胞迁移和侵袭具有显著抑制作用（图 7A）。上皮细胞标记物闭合带 (ZO-1) 和 β-连环蛋白的蛋白质表达增加，以及间充质细胞标记物波形蛋白和蜗牛家族转录抑制子 2 (Slug) 的蛋白质表达减少，进一步支持了这一观察结果（图 7B ）。此外，我们还探讨了 pritimerin 在克服化疗耐药性方面的潜力。我们评估了在存在或不存在pritimerin的情况下TNBC细胞对一线化疗药物阿霉素的敏感性。CCK-8 和 Transwell 检测结果表明，与单独治疗相比，低剂量阿霉素和低剂量 pritimerin 组合显著抑制 TNBC 细胞增殖、迁移和侵袭（图 7C、D）。一致地，这种组合还导致凋亡标记物裂解 PARP、Bax 和 Bcl-2，以及 ZO-1、β-连环蛋白、波形蛋白和 Slug 发生最显着的变化（图 7E）。这些发现共同证明 pritimerin 可以增强 TNBC 细胞对阿霉素的治疗敏感性。总而言之，我们的结果表明 pritimerin 有可能提高阿霉素在 TNBC 细胞中的治疗效果。
图7 Pristimerin 抑制 TNBC 细胞的迁移和侵袭
8 Pristimerin抑制体内TNBC细胞的生长
为了研究pritimerin对体内TNBC生长的影响，我们建立了小鼠原位TNBC模型（图 8）。结果表明，pritimerin 有效地阻碍了 TNBC 的生长，肿瘤体积和重量的减少就证明了这一点（图 8A、B）。此外，还进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析来评估肿瘤组织样本中相关蛋白的表达水平。免疫组织化学结果表明，pritimerin 以浓度依赖性方式抑制 Ki-67 的表达（图 8C）。重要的是，没有观察到重要器官病理形态的显著改变（图 8D）。此外，在动物体重或血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平方面没有观察到显著差异（图 8E，F）。这些发现表明普里蒂莫林治疗对动物没有明显的毒副作用。总之，我们的研究提供了证据支持pritimerin作为抗癌药物的治疗功效和安全性。
图8 Pristimerin 抑制体内 TNBC 细胞的生长
结论
我们发现 pritimerin 作为天然抗癌药物具有广阔的潜力，可以抑制 TNBC 细胞的生长和转移，同时提高其对阿霉素治疗的反应性。其潜在机制涉及pritimerin直接靶向并促进HSPA8蛋白的降解，从而激活VAV1/ERK信号通路，导致细胞自噬和凋亡。这些发现揭示了pritimerin的治疗靶点和作用机制，突出了其在TNBC治疗中的潜在应用。
在TNBC细胞中，HSPA8促进VAV1的降解，从而抑制ERK通路的激活，抑制细胞自噬，调节细胞增殖与凋亡的平衡。然而，在存在 pritimerin 的情况下，它直接靶向 HSPA8，促进其泛素化和降解。这进一步抑制下游客户蛋白 VAV1 的降解，导致 ERK 通路激活并介导细胞自噬和凋亡。最终，这导致细胞增殖、细胞迁移和耐药性受到抑制。
