尽管最近的研究进展为糖尿病肾病（DN）的发病机制提供了新的认识，但有效的治疗方法仍然缺乏。DN以蛋白尿和肾功能进行性下降为特征，其主要原因是足细胞损伤导致肾小球滤过屏障受损。汉黄芩苷是传统中草药黄芩中的一种生物活性化合物，其在DN中的作用尚未被探索。
2025年1月24日，上海交通大学医学院附属新华医院临床药学教研室徐阿晶团队在Phytomedicine 在线发表题为“Targeting the NF-κB p65-MMP28 axis: Wogonoside as a novel therapeutic agent for attenuating podocyte injury in diabetic nephropathy”的文章。通过dart - ms鉴定汉黄芩苷靶点为p65，汉黄芩苷对抗氧化和炎症途径的保护作用是通过p65-MMP28轴介导的，汉黄芩苷有望通过靶向NF-κB p65-MMP28信号轴治疗DN足细胞损伤。
•汉黄芩苷在体外和体内均显示出治疗DN足细胞损伤的潜力。
•确定p65是汉黄芩苷调节DN通路的关键靶点。
•汉黄芩苷通过靶向p65-MMP28轴减轻足细胞损伤。
•p65直接与Mmp28基因的启动子结合。
•MMP28可能是DN治疗的潜在靶点。
摘要
采用高脂饮食/链脲佐菌素（HFD/ stz）诱导的DN小鼠模型和高糖诱导的MPC-5细胞检测汉黄芩苷的作用。通过Western blot和RT-qPCR分析氧化应激和炎症标志物。通过dart - ms鉴定汉黄芩苷靶点，并通过SPR、分子对接、丙氨酸扫描和CETSA进行验证。通过RNA-Seq分析确定下游靶点，并通过p65敲低和过表达研究探索p65- mmp28轴。通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP-qPCR验证p65对Mmp28的调控作用。汉黄芩苷治疗显著降低体内和体外的氧化应激和炎症。机制研究证实p65是汉黄芩苷的直接作用靶点，SPR证实汉黄芩苷具有很强的结合亲和力（KD = 25.05 μM）。分子对接和丙氨酸扫描发现LYS221是关键的结合位点，CETSA利用p65 K221A突变体进一步证实了这一结果。RNA-Seq分析显示Mmp28是p65的下游效应因子，参与高糖诱导的足细胞损伤。功能研究表明汉黄芩苷对抗氧化和炎症途径的保护作用是通过p65-MMP28轴介导的。双荧光素酶报告基因实验显示p65调控Mmp28的转录，ChIP-qPCR证实其与启动子直接结合。汉黄芩苷有望通过靶向NF-κB p65-MMP28信号轴治疗DN足细胞损伤。这些发现为汉黄芩苷的治疗潜力及其分子机制提供了新的见解，为汉黄芩苷作为DN干预药物的进一步发展铺平了道路。
1.汉黄芩苷可减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠的高血糖和肾功能损伤
为了研究汉黄芩苷对DN的治疗作用（图1A），我们建立了HFD/ stz诱导的DN小鼠体内模型（图1B）。二甲双胍作为阳性对照，二甲双胍是一种公认的具有抗氧化和抗炎特性的降糖药。在10周治疗期间，每周监测体重。模型组表现出显著的体重减轻，汉黄芩苷（12.5、25和50 mg/kg）和二甲双胍（100 mg/kg）以剂量依赖性方式减轻了体重（图1C）。每两周的血糖测量结果显示，模型组的血糖值从20 mM上升至30 mM，而汉黄芩苷和二甲双胍显著降低了高血糖，大剂量汉黄芩苷的降糖效果与二甲双胍相当（图1D）。这些发现得到了糖化血清蛋白（GSP）水平降低的进一步支持（图1E）。此外，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和腹腔内胰岛素耐量试验（IPITT）表明汉黄芩苷和二甲双胍均能增强胰岛素敏感性，且高剂量汉黄芩苷与二甲双胍的效果相当（图1F， G）。为了评估肾功能，肾脏重量比测量显示模型组肾脏肥大，汉黄芩苷和二甲双胍均可改善肥大（图1H）。血肌酐（CREA）和血尿素氮（BUN）水平是肾功能的标志物，大剂量汉黄芩苷显著减轻了这些指标，但二甲双胍没有减轻（图1I， J）。蛋白尿是DN的标志，通过测定24小时尿微量白蛋白水平来评估。汉黄芩苷和二甲双胍降低了尿微量白蛋白水平，但大剂量汉黄芩苷显示出优于二甲双胍的疗效（图1K）。综上所述，这些结果表明汉黄芩苷可以改善HFD/ stz诱导的DN小鼠的高血糖和肾功能，其肾脏保护作用优于二甲双胍。
图1 汉黄芩苷可改善HFD/ stz诱导的DN小鼠的高血糖和肾功能损伤
2.汉黄芩苷可减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠足细胞损伤
通过肾组织病理染色，进一步探讨汉黄芩苷对DN小鼠肾小球的保护作用。he和PAS染色显示模型组大鼠肾小球肥大，系膜基质扩张，糖原沉积增多。高剂量汉黄芩苷和二甲双胍治疗显著减轻了系膜基质的扩张（图2A， B）。汉黄芩苷和二甲双胍均减轻了肾纤维化，大剂量汉黄芩苷显示出更大的疗效（图2A， C）。免疫组化检测Podocin的表达，进一步评估汉黄芩苷对足细胞的保护作用。模型组显示了严重的Podocin缺失，而汉黄芩苷显著改善了Podocin滞留并减少了足细胞损伤（图2D， E）。透射电子显微镜（TEM）进一步揭示了模型组的结构改变，包括肾小球基底膜（GBM）增厚和足突消失。汉黄芩苷治疗可有效缓解这些变化，表现为GBM减少增厚，足细胞足突结构恢复（图2F-I）。综上所述，这些结果表明汉黄芩苷可改善HFD/ stz诱导的DN小鼠GBM增厚，Podocin缺失和足突消失，从而对足细胞发挥保护作用。
图2 汉黄芩苷可减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠足细胞损伤
3.汉黄芩苷可减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠肾小球氧化应激和炎症反应
氧化应激和炎症是DN发病和进展的关键因素，因此它们的降低是DN治疗的关键。我们初步评估了脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）和总谷胱甘肽（T-GSH）的水平，观察到汉黄芩苷显著降低MDA水平，同时增加T-AOC、SOD和T-GSH水平，表现优于二甲双胍（图3A-D）。在转录水平上，汉黄芩苷增加了DN小鼠肾皮质中抗氧化酶Cat和Gsh-px以及抗炎细胞因子Il-10的肾脏mRNA表达，并降低了炎症介质Il-1β、Il-6、Tnf-α、Ccl-2和Nos-2的mRNA水平（图3E， F）。尽管其在体内的抗炎作用稍弱。免疫组化染色检测肾组织中超氧化物歧化酶（SOD2）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素-1β (IL-1β)的表达，以证实其减轻氧化应激和炎症的有效性。结果表明，汉黄芩苷显著增加SOD2水平，降低氧化损伤标志物4-HNE以及关键炎症介质TNF-α和IL-1β的表达（图3G-K）。汉黄芩苷显著减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠肾小球氧化应激和炎症反应。
图3 汉黄芩苷可改善HFD/ stz诱导的DN小鼠肾小球氧化应激和炎症反应
4.汉黄芩苷可减轻高糖诱导的MPC-5细胞氧化应激和炎症反应
汉黄芩苷处理剂量依赖性地降低了高糖诱导的MPC-5细胞中的ROS水平，显示了比二甲双胍更强的作用（1 mM）（图4A， B）。氧化应激的另外评估显示MDA水平降低和T-AOC增加（图4C， D）。汉黄芩苷还提高了高糖应激细胞中的SOD和T-GSH水平（图4E， F）。汉黄芩苷处理提高了抗氧化酶Cat和Gsh-px以及抗炎因子Il-10的mRNA水平，同时降低了炎症标志物Il-1β、Il-6、Tnf-α、Ccl-2和Nos-2的水平（图4G， H）。值得注意的是，汉黄芩苷减轻了高糖诱导的Podocin丢失，显示出显著的足细胞保护作用（图4I， J）。与体内结果一致。
图4 汉黄芩苷可减轻高糖诱导的MPC-5细胞氧化应激和炎症反应
5. 汉黄芩苷对其靶p65的结合作用
上述研究表明汉黄芩苷在体内外均表现出显著的抗氧化和抗炎特性。为了探索其在足细胞中的作用机制并鉴定其分子靶点，我们利用高通量dart - ms筛选了MPC-5细胞中的直接结合靶点。在确定的靶点中，p65是主要的结合靶点（图5A、B）。为了验证这一发现，我们进行了CETSA，证实汉黄芩苷与p65结合，并在47、52、57和62℃时保护p65免受热降解（图5C， D）。进一步的SPR分析显示汉黄芩苷与p65之间存在特异性结合作用，解离常数KD为25.05 μM（图5E）。为了进一步阐明结合模式，我们进行了分子对接分析。结果表明，汉黄芩苷的芳香族A环与LYS221通过磷脂阳离子相互作用，与GLU222通过磷脂阴离子相互作用，与VAL219形成氢键。芳香族B环与LYS221参与pi-烷基相互作用，并通过羰基形成氢键，而糖基段与GLN29形成氢键（图5F）。丙氨酸扫描突变鉴定出LYS221为突变能量最高的残基（图5G）。为了验证LYS221在汉黄芩苷结合中的重要性，我们使用表达野生型（WT）或k221a突变的p65的MPC-5细胞进行CETSA。K221A突变阻断了汉黄芩苷与p65的结合（图5H， I），证实了LYS221是必要的结合位点。这些结果证实汉黄芩苷在足细胞中的主要直接作用靶点是p65， LYS221是其重要的结合位点。
图5 汉黄芩苷与p65的结合。
6.汉黄芩苷对HFD/ stz诱导的dn小鼠肾脏和hg诱导的MPC-5细胞中p65信号通路的调节作用
在确定p65是汉黄芩苷的直接作用靶点后，我们试图研究汉黄芩苷对p65信号的调节作用。首先，我们检测了HFD/ stz诱导的DN小鼠肾组织中Podocin、p-p65和总p65的蛋白水平。此外，p-p65 （S536）在DN小鼠中显著升高，汉黄芩苷有效抑制了p-p65蛋白表达，但不影响总p65水平（图6A， C）。值得注意的是，汉黄芩苷没有改变MPC-5细胞中的p65 mRNA水平。为了进一步研究p-p65在DN小鼠中的表达，我们通过免疫荧光染色评估了p-p65与肾母细胞瘤1蛋白（WT-1）的共定位，WT-1是足细胞分化和GFB完整性的关键蛋白。DN小鼠p-p65水平升高，WT-1表达降低，提示足细胞损伤。汉黄芩苷显著抑制p-p65表达，同时增加WT-1水平，显示其对足细胞的保护作用（图6D-F）。鉴于p65通过核易位发挥促炎作用，我们在MPC-5细胞中进行了细胞质和细胞核分离并结合Western blot分析。高糖环境导致细胞质p65减少，细胞核p65增加，而汉黄芩苷干预显著减少了细胞核p65的转位（图6G-I）。免疫荧光染色进一步证实了这些发现，在高糖条件下，汉黄菊苷干预后p65的细胞核表达减少（图6J， K）。我们假设汉黄芩苷可能抑制这种异源二聚体的形成。免疫共沉淀（Co-IP）实验显示汉黄芩苷显著抑制p65/p50的相互作用（图6L， M），表明汉黄芩苷竞争性结合p65。
图6 汉黄芩苷对HFD/ stz诱导的DN小鼠肾脏和高糖诱导的足细胞中p65信号通路的调节作用
7.汉黄芩苷调节p65相关的下游MMP28信号通路
为了研究汉黄芩苷如何通过p65介导的信号通路减轻足细胞损伤，RNA-Seq鉴定p65在MPC-5细胞中的下游靶点。差异基因表达分析显示，与HG相比，NG条件下有24个基因上调，与Wog相比，HG条件下有269个基因下调，与si-p65相比，HG条件下有98个基因下调（图7A-C）。KEGG通路富集分析发现TNF信号通路显著富集，强调了其与我们研究的相关性（图7D）。通过将三次比较的差异表达基因交叉，我们确定Mmp28是一个重要的感兴趣基因（图7E）。为了验证MMP28在DN中的作用，我们分析了Nephroseq数据库，发现与正常肾脏（NK）相比，慢性肾脏病（CKD）患者的肾脏中MMP28表达升高（图7F）。这表明MMP28在肾脏疾病中具有潜在的有害作用。因此，在DN小鼠中，MMP28水平显著升高，汉黄芩苷治疗显著降低MMP28水平（图7G），这与体外研究结果一致（图7H）。这些结果表明，汉黄芩苷可能通过p65-MMP28轴改善足细胞损伤。
图7 汉黄芩苷调节p65的下游MMP28信号
8.汉黄芩苷通过p65-MMP28轴调控氧化应激和炎症反应，减轻足细胞损伤
为了验证p65-MMP28信号通路以及探究汉黄芩苷是否通过该通路发挥其抗氧化和抗炎作用，我们采用了不同的干预策略。最初，用p65激活剂TNF-α (1 ng/ml)刺激MPC-5细胞显著增加p-p65和MMP28的表达，逆转汉黄芩苷的治疗作用（图8A-C）。同样，汉黄芩苷增强抗氧化酶Cat和Gsh-px以及降低炎性细胞因子Tnf-α、Il-1β和Il-6的能力也显著降低（图9A）。相反，使用p65抑制剂SC75741 （5 μM）处理后，p-p65和MMP28的表达被显著抑制，低于基线水平，而汉黄芩苷将这些水平恢复到正常水平（图8D-F）。同样，SC75741增强Cat和Gsh-px，降低Tnf-α， Il-1β和Il-6的能力与汉黄芩苷平行，汉黄芩苷的添加没有进一步的益处（图9B）。
图8 p65-MMP28通路的调节
通过使用质粒过表达和RNA干扰进行基因操作，这些发现得到了加强。p65过表达显著增加p-p65和MMP28的表达，汉黄芩苷处理可部分缓解这一作用（图8G-I）。此外，过表达p65导致Cat和Gsh-px水平显著下降，Tnf-α、Il-1β和Il-6的mRNA水平显著增加，增加了数百倍；汉黄芩苷部分恢复了Cat和Gsh-px水平，并降低了细胞因子表达，但未达到正常水平（图9C）。另一方面，使用RNA干扰敲低p65显著降低了p-p65和MMP28的表达，反映了SC75741干预观察到的效果（图8j - 1）。同样，p65敲低显著增加了Cat和Gsh-px水平，并降低了Tnf-α、Il-1β和Il-6的表达（图9D）。p65过表达组与联合p65过表达和Mmp28敲低组相比，p-p65的表达水平无明显差异（图8M-O），说明Mmp28是p65的下游信号。基因水平上，联合组Cat、Gsh-px水平显著高于p65过表达组，Tnf-α、Il-1β、Il-6水平显著低于p65过表达组；汉黄芩苷没有显著的附加作用（图9E）。有趣的是，Mmp28敲低并未完全使细胞因子水平恢复正常，这可能是因为p65直接调节Tnf-α、Il-1β和Il-6水平，或者部分通过其他p65介导的促炎通路。此外，在MPC-5细胞中，p65过表达进一步加剧了hg诱导的Podocin缺失，而Mmp28敲低减轻了这一缺失，突出表明p65- Mmp28轴的激活有助于足细胞损伤（图9F， G）。
为了阐明p65和Mmp28之间的调控关系，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。HG处理增加了Mmp28的转录活性，p65过表达进一步增强了Mmp28的转录活性。同样，缺乏汉黄芩苷关键结合位点的p65 K221A突变体过表达也增加了Mmp28的转录活性，但程度略低于p65 WT（图9H）。为了确定p65是否直接与Mmp28启动子结合，我们进行了ChIP-qPCR，结果显示p65可以直接拉低Mmp28启动子，从而发挥激活作用（图9I）。这些结果表明汉黄芩苷的抗氧化和抗炎作用通过靶向p65- Mmp28轴减轻足细胞损伤，p65直接激活Mmp28促进促炎反应。
图9 通过抑制p65-MMP28轴发挥抗氧化和抗炎作用
结论
综上所述，本研究阐明了黄芩生物活性化合物汉黄芩苷通过靶向p65-MMP28信号轴对DN足细胞的保护作用。在HFD/ stz诱导的DN小鼠模型中，汉黄芩苷显著改善血糖控制、肾功能，并减轻氧化应激和炎症反应，从而减轻足细胞损伤。在体外实验中，汉黄芩苷有效地抑制了高糖诱导的氧化应激和炎症反应。机制上，汉黄芩苷直接与p65相互作用，抑制其磷酸化、核转位以及与p50的二聚化。p65活性的抑制降低了Mmp28的表达，导致下游抗氧化和抗炎作用，从而保护足细胞免受损伤。重要的是，本研究首次证明了p65直接与Mmp28启动子相互作用来调节其转录活性。这些结果表明，汉黄芩苷通过其在氧化应激和炎症中的双重调节作用，是一个有前景的DN治疗候选药物，MMP28可作为一个新的治疗靶点。
我们发现汉黄芩苷是一种新型的p65抑制剂，可以有效地减轻HFD/ stz诱导的DN小鼠和hg诱导的MPC-5细胞的氧化应激和炎症。汉黄芩苷通过直接靶向p65并抑制其下游靶点MMP28发挥保护足细胞的作用。此外，我们提供了第一个证据，p65直接结合Mmp28启动子来调节其活性。
Li X, Zhao S, Xie J, Li M, Tong S, Ma J, Yang R, Zhao Q, Zhang J, Xu A. Targeting the NF-κB p65-MMP28 axis: Wogonoside as a novel therapeutic agent for attenuating podocyte injury in diabetic nephropathy. Phytomedicine. 2025 Jan 24;138:156406. doi: 10.1016/j.phymed.2025.156406.
