溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、复发性肠道疾病，属于炎症性肠病。越来越多的证据强调了天然药用资源的药理益处。传统中药和草药以其健康益处和副作用最小而闻名，已成为一种有前景的疾病管理方法。三叶苷 (TLB) 是一种从植物性甜茶中提取的天然甜味剂，以其众多的药理特性而闻名。
| Phytomedicine | 天然产物三叶苷Trilobatin靶向SIRT2抑制衰老诱导的认知障碍 |
2025年1月21日，辽宁中医药大学李海波教授联合遵义医科大学高健美教授在Adv Sci在线发表题为“The Gut Microbiota-Xanthurenic Acid-Aromatic Hydrocarbon Receptor Axis Mediates the Anticolitic Effects of Trilobatin”的文章。TLB通过调节肠道微生物群（尤其是Akkermansia）减轻结肠炎。机制上，TLB通过纠正肠道菌群失衡、调节色氨酸代谢、增强XANA生成和激活AhR来缓解结肠炎。
摘要
溃疡性结肠炎（UC）目前的治疗方法仍然有限，这凸显了对新型治疗策略的需求。三叶苷（TLB）是一种天然衍生的食品添加剂，具有潜在的抗炎特性。本研究采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的动物模型探讨TLB对UC的影响。TLB可显著减轻dss诱导的小鼠UC，表现为降低疾病活动指数，增加结肠长度，改善组织病理学病变。此外，TLB治疗导致促炎细胞因子的减少和抗炎细胞因子的增加。TLB通过调节肠道微生物群（尤其是Akkermansia）减轻UC， Akkermansia可增强色氨酸代谢并上调黄嘌呤酸（XANA）的产生。为了证实tlb诱导的菌群变化的作用，我们进行了假无菌小鼠和粪便移植实验。XANA是介导TLB保护作用的关键代谢物。TLB和XANA均能显著激活芳香烃受体（AhR）。给予AhR拮抗剂可消除其保护作用，从而证实AhR参与了潜在的机制。综上所述，本研究揭示了TLB通过纠正肠道菌群失衡、调节色氨酸代谢、增强XANA生成和激活AhR来缓解UC的新机制。
1 TLB 通过减少小鼠肠道炎症减轻 DSS 诱导的 UC
我们首先在dss诱导的UC小鼠中研究了TLB的抗UC作用（图1A）。在实验过程中，与对照组相比，DSS小鼠表现出进行性体重减轻和较高的DAI评分（图1B，C）。TLB和SASP治疗显著减轻体重下降，改善腹泻和直肠出血，降低DAI评分。此外，DSS还引起了严重的结肠病理改变，表现为结肠长度显著减少（P < 0.001）（图1D，E），隐窝和结肠组织结构破坏（图1F，H），杯状细胞丢失（图1G，I），以及明显的炎症（包括IL-1β、IL-6、TNF-α升高，IL-4、IL-10、IL-22降低）（图1J-O）。不同剂量（10、20和40 mg kg - 1）的TLB减轻了这些病理症状，表现为体重增加，结肠长度和结构改善。此外，TLB以剂量依赖性方式恢复杯状细胞的数量并逆转细胞因子水平的变化。有趣的是，较低剂量的TLB对结肠损伤的保护作用显著优于阳性药物（SASP），表明其在体内具有抗uc活性。
图1 TLB治疗可减轻dss诱导的C57BL/6小鼠UC
2 TLB通过激活AhR改善肠道屏障功能
为了探索TLB对DSS诱导的UC的保护作用的潜在机制，我们对DSS和DSS+TLB 40 mg kg−1组的结肠RNA水平进行了转录组学分析（n = 5）。差异表达基因（DEGs）用火山图和热图表示。与DSS组相比，在TLB干预后，791个基因显著上调（例如AhR、TJP1和IL22）， 217个基因显著下调（例如IL-6和TNF）（图2A，B）。对差异表达基因的GO分析显示，炎症反应（GO:00 50728）、微绒毛（GO:00 5902）、细胞连接（GO:00 30054）和色氨酸分解代谢到犬尿氨酸（GO:00 19441）等通路富集（图2C）。KEGG分析显示TNF信号通路、紧密连接、Trp代谢显著富集，与上述结果一致（图2D）。基于这些发现，我们使用分子对接和MD模拟来预测TLB和AhR之间的相互作用。结果表明，TLB通过Gln143、Tyr154、Arg143、Leu54和Ser52等残基与AhR直接结合，结合能为- 7.899 kcal mol - 1（图2E）。进一步的MD模拟表明，TLB与AhR之间的相互作用是稳定的，TLB的结合使AhR分子更加紧密，表面积减小，并与小分子形成了许多氢键（图2F-I）。MST和SPR实验验证TLB与重组人AhR的相互作用。MST法检测TLB与AhR的直接结合。正如预期的那样，TLB很容易与AhR蛋白结合，平衡解离常数（KD）估计为1.3E−5±5.6E−6 M（图2J）。此外，根据SPR分析，与AhR结合的TLB的KD值为1.028E−5 M（图2K）。这些结果表明TLB与AhR有较强的结合亲和力。此外，我们使用ELISA和WB检测了结肠组织中的AhR水平。与对照组相比，DSS组的AhR水平显著下调，而TLB 40 mg kg−1干预显著上调AhR水平（图2L，M）。TEM显示，与对照组相比，DSS组有明显的超微结构损伤，包括紧密连接间隙增加，微绒毛减少和缩短，以及线粒体损伤（图2N-S）。TLB 40 mg kg−1处理显著逆转了这些损伤。IF染色进一步显示，与对照组相比，DSS组紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）显著下调（P < 0.001）。然而，TLB 40 mg kg−1干预显著恢复了Claudin-1、Occludin和ZO-1的水平（P < 0.001）(图2T-Y)。
图2 TLB通过激活AhR恢复肠道屏障稳态
3.TLB改善肠道菌群失调并增加AKK丰度
我们通过16S rRNA基因测序来评估TLB处理对肠道菌群的影响。dss诱导的结肠炎小鼠肠道菌群α多样性显著低于正常小鼠（P < 0.01）。正如Chao1和Shannon指数所示，补充TLB 40 mg kg - 1显著增加了α多样性（图3A，B）。非度量多维尺度（NMDS）分析表明，TLB处理使肠道微生物群组成向对照组的方向偏移（图3C）。在门水平上，与对照组相比，DSS组厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度降低，而疣菌门（Verrucomicrobiota）和变形菌门（Proteobacteria）的丰度升高。TLB逆转了这些变化，使微生物丰度更接近对照组（图3D）。在属水平上，dss处理的小鼠AKK、Bacteroides和Parabacteroides的丰度降低，而Muribaculaceae、Clostridia、Lachnospiraceae和Escherichia-Shigella的丰度增加，这些都被TLB处理逆转（图3E，F）。桑基图显示了门和属水平的物种相对丰度变化，表明TLB显著调节了dss诱导的结肠炎小鼠的肠道菌群组成（图3G）。属水平菌群与炎症因子的相关性分析显示，AKK、Muribaculum、Alloprevotella与促炎细胞因子呈负相关，与抗炎细胞因子呈正相关（P < 0.05，图3H）。利用PICRUSt 2挖掘16S RNA测序数据预测微生物基因的潜在功能，旨在初步探索生态失调与疾病之间的联系。结果提示，tlb调节的微生物群主要通过改变与结肠炎相关的代谢通路发挥作用，尤其是Trp代谢、硫代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢（图3I）。
图3 TLB可改善dss诱导的UC小鼠肠道菌群失调
4.在dss诱导的UC小鼠中，TLB改变了肠道微生物群衍生的色氨酸代谢
鉴于TLB对肠道菌群的调节作用，我们进行了代谢组学分析以鉴定功能性微生物代谢物。与未治疗的小鼠相比，dss诱导的结肠炎显著改变了代谢物水平，而TLB治疗显著恢复了这些代谢物的分布（图4A）。以ratio > 1.5或ratio < 1/1.5， Q值< 0.05,VIP > 1为阈值进行差异分析（n = 6），在DSS组和对照组的比较中，3个差异代谢物升高，33个差异代谢物降低(图4B)。在DSS + TLB 40 mg kg - 1组和DSS组之间，79种代谢物增加，23种代谢物减少(图4C）。对差异代谢物进行的后续GSEA富集分析表明，DSS组和对照组通过下调的通路（如Trp代谢、5 -羟色胺能突触以及精氨酸和脯氨酸代谢）控制了加重的UC，而DSS + TLB 40 mg kg - 1和DSS中的TLB处理逆转了这些通路的调节（图4D，E）。此外，在两次比较中发现了21个共同的差异代谢物（图4F）。热图显示了这21种代谢物在各组中的丰度，表明与对照组相比，Trp代谢物和吲哚衍生物在DSS组中显著下调。TLB处理恢复了这些代谢物的丰度，尤其是XANA（图4G）。对差异代谢物进行KEGG富集分析，Trp代谢为主要通路，与微生物组结果一致（图4H）。相关性分析表明，XANA是一个关键的差异代谢物，可能在TLB改善UC中发挥重要作用（图4I，J）。ELISA法检测血清和结肠中XANA含量，结果与上述结果一致。结果显示，TLB显著恢复了血清和结肠中XANA的含量（图4K，L）。同时，我们使用靶向代谢组学检测小鼠血清中与肠道菌群相关的Trp代谢物的变化，特别是XANA的变化。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清XANA水平降低（P < 0.001）。犬尿喹啉酸、dl -吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、3-羟基犬尿氨酸、5-羟色胺等吲哚衍生物浓度降低（P < 0.05，图4M）。然而，与DSS组相比，TLB处理逆转了这些Trp代谢物的水平。这些结果表明，TLB可能通过调节肠道菌群来源的色氨酸代谢，尤其是XANA发挥治疗作用。
图4 TLB改变了dss诱导的UC小鼠肠道菌群来源的色氨酸代谢
5.tlb调节的肠道微生物群通过上调XANA恢复肠道屏障功能
为了进一步评估TLB调控的肠道菌群是否足以产生抗uc作用，我们通过在DSS治疗前给予小鼠ABX构建了无菌结肠炎小鼠模型。然后，我们将tlb处理的UC小鼠的粪便移植到dss诱导的假无菌小鼠模型中（图5A）。对肠道微生物群的透射电镜观察显示，Vehicle组和DSS组的微生物数量均显著减少，表明微生物群成功耗尽。相比之下，DSS+FMT组的微生物数量显著增加（图5B）。此外，FMT治疗显著减轻了体重减轻，改善了腹泻和直肠出血，并降低了DAI评分（图5C，D）。此外，与DSS小鼠相比，FMT小鼠的结肠长度和组织学表现出正常趋势（图5E-J）。此外，TEM显示，与Vehicle组相比，DSS组有明显的超微结构损伤，包括紧密连接间隙增加，微绒毛减少和缩短，以及线粒体损伤（图5K-P）。FMT治疗显著逆转了这些损伤。值得注意的是，UC小鼠中减弱的肠屏障在移植tlb调节的肠道菌群后显著恢复，表现为Claudin-1、Occludin和ZO-1表达上调（P < 0.001）(图5Q-V)。有趣的是，FMT增加了血清和结肠中的XANA水平，并激活了AhR（图5W-Z）。
图5 tlb调控的肠道菌群通过上调XANA恢复肠道屏障功能
6.XANA是通过激活AhR改善结肠炎的关键活性微生物色氨酸代谢物
越来越多的研究表明，肠道微生物调节的Trp代谢失调在疾病的发病机制中发挥作用XANA是Trp代谢产物，被确定为TLB对UC疾病进展的治疗作用的关键代谢物。这一假设是基于转录组学（筛选靶基因）、微生物组学（识别差异细菌群）和代谢组学（突出关键差异代谢物）。因此，我们设计了以下实验来研究这一假设（图6A）。结果显示，与对照组相比，DSS组表现出进行性体重下降，DAI评分增加，结肠缩短。然而，XANA治疗显著逆转了这些效应（图6B-E）。此外，XANA治疗显著恢复了结肠隐窝和杯状细胞的数量，逆转了dss诱导的结肠病理损伤（图6F-I）。TEM分析显示，与DSS组相比，XANA干预恢复了肠道微绒毛的数量和长度，抑制了线粒体损伤，改善了紧密连接（图6J-O）。此外，IF染色表明，XANA处理上调了肠紧密连接蛋白的水平(图6P-U)。重要的是，与对照组相比，DSS组的AhR水平显著降低，在XANA治疗后显著恢复（图6V，W）。
图6 XANA是一种关键的活性微生物色氨酸代谢物，可通过激活AhR改善结肠炎
7.AhR是介导TLB抗uc作用的关键靶点7
已有研究表明，微生物调控Trp代谢产生的吲哚及其衍生物可以通过结合并激活AhR作为配体来预防结肠炎，表明TLB可能通过丰富代谢Trp及其代谢物XANA的肠道菌群来激活AhR来改善结肠炎。为了证实这一假设，我们将dss处理的小鼠暴露于AhR抑制剂，以验证AhR在TLB抗uc疗效中的作用。AhR拮抗剂完全消除了XANA对结肠炎的改善作用，包括体重、DAI、结肠长度、结肠组织学以及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10和IL-22的血清水平（图7A-O）。AhR抑制剂显著减弱了TLB疗法对体重、DAI、结肠长度和其他标志物的保护作用（图7A-O）。
图7 AhR是介导TLB抗肠炎作用的关键靶点
结论
TLB可显著减轻UC小鼠模型的肠道炎症，表现为DAI减少，结肠长度恢复，肠道屏障完整性改善。此外，TLB修饰UC小鼠肠道菌群，促进trp衍生的微生物代谢物XANA的产生。随后的实验表明，XANA有效地恢复了溃疡性结肠炎小鼠的紧密连接蛋白水平，并减轻了肠道炎症。这种抗炎作用是通过TLB和XANA激活AhR通路实现的。总之，TLB可调节肠道微生物群，从而增强XANA生成，从而激活AhR，改善肠道屏障完整性，最终减轻UC症状。这些发现不仅证实了TLB的抗UC特性，而且突出了其作为益生元制剂的潜力，具有调节微生物群和抗炎疗效的双重益处。鉴于TLB已被证明具有安全性、有效性和对肠道健康产生积极影响的能力，因此TLB有望成为UC治疗的候选药物。
TLB通过激活AhR和生成黄嘌呤酸减轻dss诱导的溃疡性结肠炎。UC与生态失调、代谢紊乱和肠道屏障功能受损相关。TLB可恢复微生物平衡，增强Trp代谢，产生XANA激活AhR。TLB还可直接刺激AhR，在胃肠道内发挥抗炎作用。
